李林，李建嫄，赵梅，唐伟斌
(1. 邢台学院生物科学与工程学院，河北 邢台 054001；
2. 河北医科大学附属邢台人民医院病理科，河北 邢台 054001)
随着人们生活水平的提高，乳加工产品越来越受到人们的重视，奶业也因此迎来了发展的黄金期。但是由于我国目前缺乏大面积的优质牧场，因此反刍动物在泌乳高峰期间，商家为了满足其对高能量的需要通常向日粮中增加精料比例[1-2]。当日粮中的精料比例大于60%时，就称为高精料饲喂。在高精料日粮中，由于有效纤维含量有限，所以反刍动物在咀嚼的时候唾液分泌量就会大大减少，导致瘤胃中的胃酸不能及时被稀释，加之高精料极易导致瘤胃发酵异常，因此，高精料饲喂往往会造成机体的亚急性瘤胃酸中毒(subacute rumen acidosis，SARA)[3]。SARA的发生会导致瘤胃中代谢异常产物脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等的大量释放，严重还会导致乳腺炎、蹄叶炎甚至死亡等现象发生[4-6]。
反刍动物乳腺感染外源或内源性的LPS，通常是由于环境或饮食所造成的，LPS的产生可以触发机体产生免疫应答[7-9]。Chang等[10]研究发现，高精料诱导的奶牛机体出现的SARA症状及血液LPS升高，会造成乳腺脂肪酸合成受阻，而脂肪酸是乳脂的重要组成部分。腺苷酸活化激酶(AMPK)作为一个“传感器”可“调节”细胞中的能量。AMPK信号通路在脂质代谢中起着重要作用，激活AMPK可以抑制脂质合成。
目前，该方面的研究多集中在奶牛的体内试验，而在体外的乳腺细胞及具体机理方面的研究相对较少。因此，本试验利用奶牛乳腺上皮细胞作为模型，通过向细胞中添加不同浓度的LPS，观察细胞的存活力、炎症因子及探讨调控乳脂合成的具体信号机制，旨在为养殖实践中奶牛乳腺炎的防治及乳品质的提高提供理论依据。
1.1 奶牛乳腺上皮细胞系
奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T由南京农业大学张源淑教授馈赠。
1.2 MAC-T细胞的培养和传代
MAC-T细胞在DMEM培养基中进行培养，内含10%的胎牛血清、100 U/mL的青霉素/链霉素和4.5 g/L葡萄糖，置于含5% CO2的恒温培养箱(37 ℃)中培养，根据细胞生长状态，及时更换新鲜培养基，每隔2～3 d将细胞重新传代1次。当细胞融合度达到80%～90%时，用贴壁细胞用消化液(含0.25%胰酶、0.02% EDTA)进行消化处理，1 500 r/min离心5 min，小心弃掉上清，分别将细胞接种于6孔板、12孔板以及96孔板中，分别加入新鲜培养基，置于恒温培养箱中培养。
1.3 LPS诱导MAC-T细胞损伤模型的建立
1.3.1 LPS诱导细胞损伤试验
接种于96孔板内的MAC-T细胞，融合度达到70%～80%时弃去培养液。PBS洗涤后，分别加入含有不同浓度LPS的无血清培养基(LPS浓度分别为0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 000 ng/mL、10 000 ng/mL)；
在5% CO2恒温培养箱(37 ℃)中分别培养1、3、6、9、12 h。每组设置10个平行孔。
1.3.2 乳腺上皮细胞MTT试验
当各组细胞按上述处理完成后，96孔板内更换新鲜无血清培养液，并在每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT溶液(购自上海碧兴天生物技术有限公司)，在5% CO2的恒温培养箱(37 ℃)继续培养4 h后，将上清弃去，每孔分别加入150 μL DMSO溶液，微量振荡器振荡，于RT-6000半自动生化分析仪上检测各孔490 nm处的吸光度值。
1.4 MAC-T细胞炎症因子检测
将12孔板中的MAC-T细胞融合度达到70%～80%时，弃去培养液。PBS洗涤后，分别加入含有不同浓度的LPS(0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 000 ng/mL、10 000 ng/mL)无血清培养基；
在5% CO2的37 ℃恒温培养箱中分别培养9 h，每组设置6个平行孔。收集细胞用超声波细胞破碎仪进行破碎，4 °C，2 500 r/min离心10 min，取上清。分别检测不同组细胞肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)的含量，操作步骤按照说明书进行。细胞因子检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.5 MAC-T细胞甘油三酯(TG)含量检测
MAC-T细胞与不同浓度的LPS孵育，9 h后收集MAC-T细胞，超声波处理器进行细胞破碎处理，4 ℃，2 500 r/min离心10 min，取上清。用甘油三酯检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)测定甘油三酯含量。
1.6 Western blot分析MAC-T细胞AMPK通路蛋白
将细胞用含1% AMPK蛋白酶抑制剂(购自上海蓝木化工有限公司)的裂解缓冲液处理5 min。然后将匀浆液以12 000 r/min速度离心，4 ℃条件下离心10 min。用蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度。用聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质。然后转移至PVDF膜，将膜用5%脱脂奶粉封闭2 h，然后将一抗AMPK-兔和p-AMPK-兔(购自艾博抗上海贸易有限公司)1∶5 000 稀释。4 ℃，杂交过夜，与相应的二抗辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(H+L)(购自上海碧云天生物技术有限公司)，共同孵育1 h，用ECL发光液进行Western blot图像处理。用Image Lab 6.0分析条带灰度值。
1.7 MAC-T细胞脂代谢相关关键酶的表达
MAC-T细胞与不同浓度的LPS孵育9 h后收集MAC-T细胞，将收集的细胞采用TRIzol法直接提取总RNA，利用BioPhotometer测定样品总RNA浓度，分析OD260/OD280值，判断提取总RNA的纯度，OD260/OD280需要在1.8～2.0范围之内。取1 μg总RNA进行反转录得到cDNA，详细操作步骤参照说明书进行。
根据GenBank上牛的乙酰CoA羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰辅酶A去饱和酶-1(SCD-1)、脂肪酸移位酶(CD36)及β-actin内参基因引物，参照GenBank序列，用Primer Premier 5软件自行设计，设计完成后交由上海Sangon公司合成，引物序列见表1。
表1 目的基因及β-Actin引物序列
1.8 AMPK抑制剂对MAC-T细胞TG含量的影响
当MAC-T细胞融合度达到70%～80%时，弃去培养液。试验分为3组，分别为对照组、LPS处理组(1 000 ng/mL)、AMPK抑制剂组(10 μmol/L BML-275+1 000 ng/mL LPS)，在5% CO2的37 ℃恒温培养箱中分别培养9 h后，收集MAC-T细胞，超声波处理器进行细胞破碎处理，4 ℃，2 500 r/min离心10 min，取上清。用甘油三酯检测试剂盒测定甘油三酯含量。
1.9 AMPK抑制剂对MAC-T细胞脂代谢相关关键基因的影响
将上述3组细胞分别进行培养9 h后，收集MAC-T细胞，将收集的细胞采用TRIzol法直接提取总RNA，然后通过反转录得到cDNA，详细操作步骤参照说明书进行。
1.10 统计与分析
数据均以“平均值±标准差”表示，MTT法通过采用SPSS 19.0(SPSS，USA)统计软件进行独立样本t检验分析，其他试验结果进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，并采用LSD法进行多重比较，以P<0.05表示差异显著，P<0.01表示有极显著性差异。
2.1 LPS对MAC-T细胞相对活力的影响
试验结果表明，从6 h开始经不同浓度的LPS处理后MAC-T细胞的相对活力开始下降，其中在1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS的处理下细胞的相对活力显著低于对照组(P<0.05)；
从9 h开始，1 000 ng/mL和10 000 ng /mL LPS的处理下，细胞相对活力极显著低于对照组(P<0.01)(图1)。根据检测结果，确定LPS诱导MAC-T细胞炎性损伤最佳刺激时间为9 h。
与对照组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)图1 LPS对MAC-T细胞相对活力的影响(n=10)
2.2 LPS对MAC-T细胞炎症因子的影响
如表2所示，用1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，与对照组相比，MAC-T细胞中TNF-α和IL-8含量显著上升(P<0.05)；
而用10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，与对照组相比，细胞内的IL-6含量显著上升(P<0.05)。
表2 LPS对MAC-T细胞炎症因子指标的影响 μg/L
2.3 LPS对MAC-T细胞TG的影响
如图2所示，与对照组相比，用100 ng/mL、1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，MAC-T细胞内TG含量显著下降(P<0.05)。
不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同图2 LPS对MAC-T细胞TG含量的影响
2.4 LPS对MAC-T细胞AMPK信号通路的影响
检测细胞内的AMPK蛋白水平，结果如图3所示。用1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，细胞内P-AMPK水平与对照组相比显著升高(P<0.05)。
图3 P-AMPK蛋白含量的检测
2.5 LPS对MAC-T细胞脂代谢相关酶mRNA表达的影响
通过对MAC-T细胞脂肪酸激活、转运、合成关键酶mRNA水平的检测。结果由图4所示，与对照组相比，用100 ng/mL、1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，与ACC、SCD-1的相关基因显著降低(P<0.05)；
在1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，FAS基因也显著降低(P<0.05)。提示：LPS会影响MAC-T细胞脂肪酸的从头合成及TG含量，进而影响乳脂的生成。
A. ACC；
B. SCD-1；
C. FAS；
D. CD36图4 LPS对MAC-T细胞脂代谢相关基因的影响
2.6 AMPK抑制剂对MAC-T细胞TG含量的影响
向细胞中添加AMPK抑制剂BML-275后，各组MAC-T细胞TG含量测定结果见图5。LPS处理组中TG含量显著下降(P<0.05)，而AMPK抑制剂组中TG含量与LPS处理组有上升的趋势，但差异不显著(P>0.05)。
图5 AMPK抑制剂对MAC-T细胞TG含量的影响
2.7 AMPK抑制剂对MAC-T细胞脂代谢相关酶mRNA表达的影响
向MAC-T细胞添加AMPK抑制剂BML-275后，MAC-T细胞脂代谢的相关酶mRNA表达水平的测定结果见图6。用1 000 ng/mL LPS刺激9 h后，与对照组相比，ACC(图6A)、FAS(图6B)、SCD-1(图6C)的相关基因显著降低(P<0.05)；
而向细胞中加入BML-275后，与LPS处理组相比，上述基因显著上升(P<0.05)。经过LPS处理后CD36基因表达差异不显著(P>0.05)，图6D。
A. ACC; B. FAS; C. SCD-1; D. CD36图6 AMPK抑制剂对MAC-T细胞脂代谢的影响
3.1 LPS对MAC-T细胞活性及炎症指标的影响
泌乳期的高产奶牛，养殖户为了弥补其能量不足，往往就会逐渐增加饲料中的精料比。然而，大量饲喂高精料日粮会导致瘤胃快速发酵，瘤胃中的挥发性脂肪酸和乳酸水平升高就会导致氢离子增加，从而导致pH值降低。pH值的降低改变了瘤胃微生物群，杀死了革兰阴性菌，导致大量LPS从死亡细胞表面释放出来进入血液[12-13]。
LPS经过血液的体循环后引发机体的炎症，同时也会进入乳腺引发泌乳功能出现障碍。Guo等[14]通过高精料饲喂泌乳期奶牛1个月后，发现瘤胃及血液中LPS含量显著升高，并且造成了机体的SARA。Chang等[15]研究发现，高精料饲喂不仅导致了奶牛机体的SARA，同时瘤胃所产生的大量LPS进入血液后通过乳动脉流入乳腺，造成了奶牛的乳腺炎、影响了乳蛋白的合成。Memon等[16]研究发现，精粗比为6∶4的日粮会造成奶牛机体SARA的产生，并且在乳腺组织中会激活与炎症相关的信号通路。实验证明，高精料饲喂泌乳奶牛，会通过NF-κB信号通路激活核苷酸结合寡聚体结构域蛋白1进而引发乳腺的炎症反应，使乳腺中炎症因子上升[17]。白介素和肿瘤坏死因子是参与调节免疫反应、造血和炎症反应的典型的多功能细胞因子，它们的功能广泛重叠，但各有其独特的特性。其中，IL‐6具有调节免疫系统和神经系统的功能[18]；
TNF-α是细胞凋亡、炎症和免疫的主要中介因子，它与疾病的发病机制有关，包括败血症、糖尿病、癌症[19-20]。本试验通过体外细胞研究发现，用不同浓度的LPS分别刺激MAC-T细胞发现，1 000 ng /mL LPS和10 000 ng/mL LPS的处理下细胞相对存活率从6 h开始显著下降，在9 h和12 h的时候下降极显著。提示，随着时间的延长和LPS浓度的升高，会造成MAC-T细胞存活率下降。进一步检测与细胞氧化应激的相关指标，发现1 000 ng/mL 和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，MAC-T细胞中IL-8和TNF-α含量显著上升；
而用10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，细胞内的IL-6含量显著上升。提示，LPS不仅造成了细胞的炎症状态，同时也使更多的细胞发生了非正常凋亡。
3.2 LPS对MAC-T细胞脂合成代谢及相关通路的影响
乳脂肪主要是由TG(含量为97%)、胆固醇等营养成分组成[11]。研究发现，当乳腺处于炎症状态时，用于合成乳脂肪的前体物就会减少，进而导致乳中乳脂肪含量降低[21]。TG中的脂肪酸组成与饲粮中脂肪酸、饲粮碳水化合物/脂质比和种属都有关。乳中的TG通常有3种来源:乳腺从头合成、膳食脂类和内源性脂肪储存(脂肪或肝脂类)。在反刍动物中，乳腺乳脂肪的从头合成途径对TG合成具有重要作用，乳腺的从头合成途径是一个极其复杂的过程。该过程需要一系列相关酶类的调节。其中ACC在大多数生物体内的脂肪酸代谢中起着关键的作用，它通过生物素羧化酶和羧基转移酶两种催化活性，催化乙酰辅酶A的羧化生成丙二酰单酰辅酶A[22-24]。SCD是调节饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸转化的主要酶，也是调节肥胖基因代谢途径的主要成分[25]。研究发现哺乳动物在泌乳期间，乳腺上皮细胞中与脂肪酸合成的关键酶，ACC等都会显著上调[26]。AMPK是真核生物细胞和机体代谢的中枢调节因子之一，当细胞内ATP产生减少时，AMPK就会被激活。AMPK在调节生长和机体代谢方面起着关键作用[27-28]。本研究发现，AMPK的磷酸化会增加组织中葡萄糖摄取、脂肪酸氧化。本试验中，用100 ng/mL、1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，MAC-T细胞中脂肪总含量及TG含量显著下降。进一步通过分析与脂代谢相关的关键通路蛋白及关键酶，发现1 000 ng/mL 和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，MAC-T细胞中P-AMPK蛋白表达量显著上升；
100 ng/mL、1 000 ng/mL 和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，MAC-T细胞中ACC、SCD-1含量显著下降，并且1 000 ng/mL 和10 000 ng/mL LPS刺激后，其FAS含量也出现显著下调。此外，通过向细胞中添加AMPK抑制剂(BML-275)，发现LPS组TG含量与对照组相比显著下降，而AMPK抑制剂组TG含量有上升趋势，但差异不显著。通过对与脂代谢相关的关键酶分析，发现与对照组相比，ACC、FAS、SCD-1的相关基因显著降低；
而向细胞中加入BML-275后，AMPK抑制剂组与LPS处理组相比，ACC、FAS、SCD-1相关基因显著上升。提示：LPS造成了MAC-T细胞TG含量的下降，并且影响了脂代谢合成途径，导致TG含量下降，影响了乳脂肪的合成。
综上，本研究结果发现，通过向MAC-T细胞中添加LPS，不仅造成了细胞的活性下降，还导致了细胞炎症；
LPS通过AMPK信号通路造成了MAC-T细胞脂合成代谢关键基因活性下降，TG的合成能力下降。分析其原因，可能是由于在炎症状态下，MAC-T细胞首先将胞内物质经过转化后用于抵抗细胞的应激状态，而消耗了大量的乳脂前体物用于机体供能，进而通过AMPK信号通路影响乳脂合成。