侯文渊，朱彩玉，朱磊，顾一帆，周正新
1 安徽中医药大学 安徽合肥 230038
2 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031
激素性股骨头坏死（Steroid induced necrosis of femoral head，SANFH）是股骨头的多种组织成分如骨髓造血细胞、骨组织和脂肪细胞等活性组织在高剂量激素刺激下而死亡的病理过程[1]。据报道，有55.75%的女性和26.35%的男性股骨头坏死是糖皮质激素所导致[2]。由于SANFH的发病年龄往往青年化且难以治愈，因此已经成为年轻人髋关节残疾最常见的原因之一[3]。
骨痹通消颗粒是全国名中医丁锷教授在骨蚀宁方的基础上，倡导补肾活血通络大法化裁而来。骨痹通消颗粒（丹参 15g，川芎 10g，当归 10g，赤芍 12g，淫羊藿 10g，续断 10g，肉桂 4g，土鳖虫 6g，甘草 6g）由安徽中医药大学第一附属医院制成颗粒剂，其最主要的药理作用是补肾、活血、通络。已有研究表明，应用该复方治疗股骨头坏死在临床上效果显著[4]。动物试验数据表明，骨痹通消颗粒可能有助于改善类固醇诱导的股骨头坏死的进展[5]。然而，其关键活性化合物、潜在靶点以及作用途径尚不清楚。
近年来，系统药理学的一般解决方案被提出，研究多靶点化合物影响中药生物网络的多种分子机制已成为当前研究的热点。因此，本研究采用系统药理学的方法，结合分子对接和分子动力学模拟等手段探讨中药复方骨痹通消颗粒对SANFH的药理作用机制。
1 复方成分和靶点的筛选
复方骨痹通消颗粒由丹参、川芎、当归、赤芍、淫羊藿、续断、肉桂、土鳖虫和甘草9味中药组成，我们在 TCMSP数据库（https：//tcmsp-e.com/）以及 SwissTargetPrediction数 据 库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）上以口服生物利用度（OB ≥ 30%）和类药性（DL ≥ 0.18）作为筛选条件，对骨痹通消颗粒的9味中药进行化学成分及其作用靶点的筛选。
然 后，我 们 使 用 UniProt数 据 库（https：//www.uniprot.org）将这些药物靶点的蛋白名称转化为基因Symbol。值得注意的是，TCMSP数据库未涵盖中药土鳖虫，因此，我们通过大量查阅文献收集到土鳖虫化学成分及预测成分作用的所有靶点。
2 疾病靶点的筛选
我们使用 GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）、OMIM 数 据 库（http：//www.omim.org）和PharmGKB 数据库（https：//www.pharmgkb.org/），以疾病英文缩写“SANFH”作为关键词进行检索，得到相关疾病靶点。然后将上述三种数据库中获得的疾病靶点进行Excel列表汇总，确定SANFH的相关靶点，然后将整理所得复方的靶点和药物的靶点取交集。
3 复方药物-成分-靶点网络与蛋白质相互作用网络构建
CytoScape 3.8.0软件被用来构建药物-成分-靶点网络图。为了阐明骨痹通消颗粒靶点与SANFH疾病靶点间的作用关系，我们利用R 4.1.1软件计算两者的交集靶点，然后使用STRING数据库（https：//string-db.org）构建蛋白质相互作用网络，使用Cyto-Scape软件确对网络的拓扑形态进行进一步分析。
4 基因富集分析
继上一步分析的结果，使用Metascape数据库（http：//metascape.org/gp/index.html）进 行 GO（生 物过程）分析，根据Q值，对排名前20的生物学过程使用R软件绘制气泡图，并对排名前20的KEGG通路进行可视化分析，筛选出可以用于解释骨痹通消颗粒治疗SANFH的通路。
5 成分-靶点分子对接验证
分子对接开始之前，我们将分析得到的靶点和成分一一对应，然后置于PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取骨痹通消颗粒关键活性成分的Smiles格式，使用Chem3D 19.0软件获得对应的小分子pdb文件，使用PDB数据库下载核心靶点的PDB 文件。使用 DS（Discovery Studio 4.5 Client）蛋白大分子处理软件处理，最后由 AutoDock Tools Vina 1.1.2软件进行分子对接，得到对接的结合能以及相应的配体-受体结合的3D图。
6 分子动力学模拟
分子动力学模拟（Molecular Dynamics Simulation，MD）主要是依靠牛顿力学模拟配体在蛋白体系的运动情况，在配体运动进行每个步骤的同时，抽取状态样本数据进行体系的构型分数计算，并根据计算结果进行诸如均方根误差（RMSD）和均方根浮动（RMSF）的呈现。进行分子对接后，尽管有很多体系的结合效果很好（结合能高），但是我们并不知道当施加人体环境作用后，该体系是否依然稳定。
进行MD模拟的方法有很多，但最有效且公认的方法是通过GROMACS进行的，因此，我们的MD模拟也是基于GROMACS程序包的，在MD模拟开始之前，我们预先设置了一系列参数进行体系的平衡，比如使用水分子的TIP3P模型，溶剂环境为中性氯化钠溶液，温度为开尔文温度310K（约为人体的36.85℃），在1个标准大气压下开始MD模拟。
最后，我们使用Origin 2018软件对RMSD结果进行可视化，得到了RMSD（nm）随时间（ns）变化的三体系折线图。
1 药物成分与靶点筛选
我们借助TCMSP数据库检索骨痹通消颗粒中9味中药的成分，共检索到有效成分丹参65个，川芎7个，当归2个，赤芍29个，淫羊藿23个，续断8个，肉桂65个，土鳖虫18个以及甘草92个。部分有效成分见表1。
表1 骨痹通消颗粒部分化合物成分
然后我们借助SwissTargetPrediction、TCMSP和Perl语言预测到丹参的有效成分靶点932个，川芎的有效成分靶点42个，当归的有效成分靶点69个，赤芍的有效成分靶点158个，淫羊藿的有效成分靶点511个，续断的有效成分靶点63个，肉桂的有效成分靶点166个，土鳖虫的有效成分靶点1445个以及甘草的有效成分靶点1769个，将这9味中药的作用靶点合并后去重共得到靶点678个。
2 成分靶点与疾病靶点交集
借助GeneCards、OMIM和PharmGkb三个疾病靶点数据库得到SANFH相关的所有靶点，分别得到1367个，120个和380个结果。我们使用R 软件将SANFH疾病靶点及所有药物成分靶点进行筛选筛选，去除重复的靶点后，使用R 软件将成分靶点和疾病靶点取交集，同时绘制出交集的Venn图（见图1），得到SANFH靶点共1644个，其中，所有中药有效成分靶点共678个，SANFH和中药有效成分的交集靶点共283个。
图1 SANFH靶点和药物靶点的交集
3 中药调控网络图的构建
我们将筛选到的中药成分和成分-疾病交集靶点借助R软件和Cytoscape软件绘制中药-成分-靶点网络（见图2）。骨痹通消颗粒治疗SANFH相关的中药有效成分共199个（其中关于土鳖虫的有效成分17个，当归2个，续断4个，肉桂14个，淫羊藿16个，川芎6个，丹参58个，甘草88个，赤芍12个）。对应交集靶点数目排名前十的有效成分及其来源：槲皮素（甘草）、十六碳烯酸（肉桂，土鳖虫）、肉豆蔻酸（土鳖虫）、棕榈酸（土鳖虫）、十六碳-9，12-二烯酸（土鳖虫）、4"，5-二羟基 -7-甲氧基黄酮（土鳖虫）、月桂酸（土鳖虫）、鲨甘醇（土鳖虫）、十四碳烯酸（土鳖虫）、山萮酸（土鳖虫）；
其中最多者槲皮素对应96个靶点，最少者山嵛酸对应43个靶点。推测骨痹通消颗粒主要通过以上有效成分来发挥SANFH的治疗作用，应予以重视和进一步研究。
图2 骨痹通消颗粒治疗SANFH的中药-成分-靶点网络
在中药-成分-靶点网络图中，绿色结点代表药物，蓝色结点代表活性成分，其中紫色结点代表共同活性成分，红色结点代表靶点，中药-成分-靶点网络中共汇集了4229条边，888个结点。
4 蛋白互作网络（PPI）的构建
为了阐明靶点蛋白间的相互作用，将交集的283个靶点提交至STRING 11.0数据库，物种选择Homo sapiens，相互作用结合分数≥ 0.7，去除游离无连接的节点，构建蛋白互质（PPI）网络模型（见图3），网络共有268个节点，2141个边，其中，结点为靶点，连线为靶点之间存在互作关系，结点的颜色、大小以PPI得分绘制，结点越大且结点颜色越深表示两靶点在该网络越重要。节点度值最大81，中位数41以上的16个靶点视作核心靶点，并构建核心靶点PPI网络（见图4），图中结点代表核心靶点，连线代表核心靶点之间存在互作关系，颜色与度值呈正相关，颜色越深表示靶点在该网络中越重要。
图3 骨痹通消颗粒-SANFH靶点PPI网络
图4 关键靶点的蛋白相互作用网络
我们继续使用CytoScape自带的MCODE分析PPI网络，确定潜在蛋白质相互作用拓扑网络。MCODE分析发现，共11个拓扑网络，每个拓扑结构中的蛋白有着更为紧密的联系，作score得分前5个拓扑模块的网络图（见图5）。
图5 交集靶点PPI网络中的拓扑子网络
5 GO富集分析和KEGG通路分析结果
为了使富集结果具有统计学意义，我们将P<0.05作为GO富集分析（生物过程）和KEGG通路分析的条件，并将P值排在前20的条目通过R软件绘制出气泡图。其中，GO生物过程富集分析得到607个条目（见图6a），对应靶点60个，KEGG通路分析得到162条信号通路（见图6b），对应靶点49个。
图6 （A）GO富集分析（生物过程）（B）KEGG富集分析
可见，骨痹通消颗粒是通过参与多种生物过程和多种通路来发挥作用的。通过比较富集分析的靶点排名以及分布情况，综合考虑TP53、AKT1、SRC、STAT3、MAPK3、JUN、MAPK1、EGFR、IL6、ESR1、MYC、RELA、CASP3、VEGFA、IL1B 和 RXRA 等 16个以上的靶点具有较为重要的作用。
6 成分-靶点分子对接验证分析结果
本研究选取骨痹通消颗粒活性成分中Degree值排名前3的关键药效物质槲皮素、肉豆蔻酸及棕榈油酸（Quercetin、Myristic acid 和 Palmitoleic acid），分别与核心靶点TP53、AKT1和SRC进行分子对接，结合能结果见表2。
表2 分子对接详细结果
使用PyMol软件将对接结果进行可视化（见图7），从图中我们可知，Quercetin与AKT1靶点的氨基酸残基 ASN-54、GLN-79、LEU-210和 SER-205形成氢键，与TP53靶点的氨基酸残基ALA-138、ARG-196、SER-166、ASP-186和 ASN-200形成氢键，与SRC靶点的氨基酸残基LYS-298、THR-341、ASP-407、GLU-342 和 MET-344 形成氢键；
Myristic acid 与AKT1靶点的氨基酸残基VAL-271、ASN-54和GLN-79形成氢键，与TP53靶点的氨基酸残基SER-166和ARG-196形成氢键，与SRC靶点的氨基酸残基GLY-279形成氢键；
Palmitoleic acid与 AKT1靶点的氨基酸残基THR-82、THR-81和ASP-292形成氢键，与TP53靶点的氨基酸残基ARG-196和ASN-235形成氢键，与SRC靶点的氨基酸残基LYS-298形成氢键。对接结果表明，当骨痹通消颗粒中的三种关键成分结合于SANFH的靶点上时，SANFH的靶点表现出较为稳定的三级结构。
图7 关键药效物质-核心靶点分子对接
7 分子动力学模拟结果
显而易见，我们根据分子对接的结果可以看到槲皮 素 与 TP53（-8 kcal/mol）、AKT1（-9.6 kcal/mol）和SRC（-10.1 kcal/mol）三个靶点有着较好的结合能效果，然而，MD模拟的结果并没有像预想的一样与分子对接结果对应（见图8），可见MD模拟的重要性。
图8 三个体系的MD模拟结果（RMSD）
MD模拟结果显示，分子对接结合能最高的SRC靶点在人体中却没有特别稳定的结构状态，但是该体系的RMSD波动较为微小，有一定的研究价值。相反，槲皮素与AKT1无论是在结合能上还是在RMSD中，都表现出较为稳定的结合构象，而槲皮素与TP53的RMSD结果表现得更加糟糕，甚至不值得进行下一步研究。
自从Pietrogrande1953年首次报道股骨头坏死与激素相关以来[6]，SANFH引起了越来越多的学者的关注。目前，尽管提出了许多发病机制假说，如脂质代谢紊乱、骨髓间充质干细胞成脂分化、血管内凝血、细胞凋亡、氧化应激等[7-8]，但针对SANFH具体的发病机制仍然没有统一的结论。
股骨头坏死在中医归为“骨痹”“骨蚀”“骨痿”范畴，如《素问·长刺节论篇》指出“骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名骨痹”[9]。许多医家认为，骨痹以肝肾亏虚为主要病因，气滞血瘀是其病理基础，治宜补益肝肾，活血化瘀[10-12]。周正新教授以补肾活血为原则，在临床上使用骨痹通消颗粒治疗股骨头坏死效果明显，但由于中药成分的复杂性和疾病发病机制的多样性，骨痹通颗粒治疗股骨头坏死的药理机制的探索仍处于初期阶段，极大地限制了其临床应用和发展。
通过构建“药物-成分-靶点”网络，筛选出网络关系中Degree排名前3的药物活性成分，分别为槲皮素、肉豆蔻酸及棕榈油酸。其中，槲皮素是方中淫羊藿、甘草的主要活性成分。研究表明，槲皮素不仅可以通过miRNA-206/Cx43通路刺激骨髓间充质干细胞成骨分化，促进成骨细胞增殖，防止骨质丢失[13]。还可以通过抑制IRAK1/NLRP3信号通路，下调IRAK1、NLRP3和caspase-3的表达水平，抑制炎症和凋亡，减轻关节软骨的退化和侵蚀[14]。此外槲皮素还可通过p-38α/β信号通路抑制巨噬细胞极化并调节OPG/RANKL平衡，减轻全髋关节置换术后假体磨损颗粒导致的炎症反应[15]。肉豆蔻酸和棕榈油酸是土鳖虫的主要活性成分。研究证明，膳食脂肪酸可以调节代谢和免疫反应，提高全身胰岛素敏感性，刺激β细胞分泌胰岛素，增加肝脏脂肪酸氧化，改善血脂水平，并改变巨噬细胞的分化[16]。另外在LDLR-KO（低密度脂蛋白受体缺陷）小鼠中，添加棕榈油酸可降低动脉粥样硬化的发展，并与改善脂质和糖代谢以及参与脂肪生成和炎症的调节基因有关，表明棕榈油酸在代谢紊乱方面的具有潜在作用[17]。研究发现，肉豆蔻酸通过抑制RAGE、Keap1的上调和Nrf2、NQO1、HO1、SOD、CAT和GPx的下调，使细胞免受氧化应激。还可以通过降低炎症（NF-κB，p65，IKKβ，TNF-α，IL-1β 和 iNOS）和凋亡（Bax和 caspase-9），升高抗凋亡（Bcl-2）标志物水平来阻止炎症和凋亡的增加[18]。通过上述结果，课题组认为，骨痹通消颗粒主要通过君药淫羊藿、土鳖虫中有效活性成分如槲皮素、肉豆蔻酸等，来调节脂质代谢，抑制炎症的反应，阻止细胞凋亡，从而延缓SANFH的发生发展。
PPI网络分析发现AKT1、SRC和TP53为治疗SANFH的核心蛋白。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，被称为AKT激酶（AKT1、AKT2和AKT3）[19]。AKT1具有调节细胞增殖、代谢、凋亡以及血管生成、血液流速、组织重塑的能力，已被提出作为促进血管生成相关的治疗靶点，在股骨头缺血性坏死中治疗中发挥着重要的作用[20]。SRC是一种酪氨酸蛋白激酶，在细胞生长、分裂、迁移和生存信号通路中发挥关键作用[21]。TP53蛋白是一种抑制异常细胞生长的肿瘤抑制因子，功能性TP53被认为可以感知DNA损伤，随后诱导异常细胞的DNA修复、生长阻滞或凋亡[22]。同时TP53和Parkin共同调节骨髓间充质干细胞中的线粒体吞噬，可以促进早期激素诱导的ONFH的修复[23]。
GO功能富集分析结果表明，骨痹通消颗粒治疗SANFH的283个潜在靶点的主要生物学过程涉及激素代谢过程、生物对脂多糖、细菌源分子、药物、氧化应激的应答过程。KEGG通路富集结果表明，核心靶点对应的显著信号通路主要包括脂质代谢紊乱、AGE-RAGE通路、白细胞介素17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、内分泌抵抗通路。这些通路主要与脂质代谢紊乱、炎症反应、血管生成、骨代谢及免疫调节等有关，且相互之间有着协同效应，其中脂质代谢通路拥有最低的P-value和最多的富集基因数。由激素诱导的脂质代谢紊乱引起的股骨头坏死主要有两种机制：微血管脂肪栓塞和骨细胞脂肪沉积[24]。相关研究表明由于使用激素，皮下脂肪动员增加。随着给药时间的延长，血脂水平呈增加的趋势，进而导致脂质分布异常，微血管内脂肪栓塞，髓腔内脂肪堆积，脂肪细胞体积增大，髓腔内压力升高[25]。现有研究已经证实脂质代谢紊乱是激素性股骨头坏死发展过程中的重要环节[26]。因此，课题组推测骨痹通消颗粒主要通过调控糖皮质激素引起的脂质代谢紊乱，减轻股骨头内微小动脉的脂肪沉积和脂肪栓塞，降低骨内压，促进血流通畅，来达到防治SANFH的目的。
分子对接结果显示，骨痹通消颗粒中关键药效物质槲皮素、肉豆蔻酸及棕榈油酸与核心靶点蛋白AKT1、SRC及TP53能够稳定地结合，表明骨痹通消颗粒可能作用于上述靶点，从而治疗SANFH。而MD模拟验证结果表明，槲皮素与AKT1的复合物体系能够稳定存在于人体，并且不会产生其他不良影响，因此槲皮素与AKT1的结合可成为治疗SANFH的新思路。
综上所述，本研究以骨痹通消颗粒和SANFH为探讨对象，以系统药理学为基础，结合SANFH的病理机制，排除缺乏特异性的信号通路，我们推测骨痹通消颗粒通过调节脂质代谢和氧化应激等信号通路发挥补肾、活血、通络的功效，这可能是其治疗SANFH的作用机制之一。为后续的研究提供了理论支撑，为临床用药及靶向新药研发提供了导向支持。
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