宋 敏 王超普 崔艺燕 邓 盾 余 苗 刘志昌 田志梅 容 庭 李贞明 马现永,2*
(1.广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东畜禽肉品质量安全控制与评定工程技术研究中心，广州510640；
2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，茂名525000)
随着现代畜禽养殖业的规模化、集约化发展，养殖场产生的臭气污染已成为制约畜禽养殖可持续发展的瓶颈，也是畜禽生态养殖过程中亟待解决的技术难题。臭气主要是由动物胃肠道中未被利用的营养物质和内源性产物经厌氧微生物发酵生成的代谢物，因此肠道微生物在调控畜禽粪便中臭气物质生成的过程中扮演着重要角色。臭气的主要成分为氨气、挥发性含硫化物、胺类、酚类、吲哚类和挥发性脂肪酸类物质等[1]。养殖过程中产生的臭气主要来自尿液和粪便，在封闭和半封闭的养殖舍内，臭气物质不仅使畜禽易患呼吸道疾病，影响畜禽的生产性能和健康状况，还对场内管理人员的健康及周围的生态环境造成严重的危害。因此，如何治理畜禽养殖场的臭气污染成为了近年来养殖行业关注的热点问题。臭气的产生受到多种因素的影响，如饲料成分、环境因素、动物健康状况以及粪便的处理方式等。到目前为止，人们对畜禽养殖臭气的研究多集中在臭气的无害化处理上，却很少有研究关注从源头上减少臭气物质的生成。研究表明，饮食与臭气物质的产生直接相关，例如低蛋白质及高纤维饲粮能有效降低畜禽粪便中的臭气物质[2]。此外，饲料添加剂也可通过提高饲料消化率或改变粪便pH来抑制臭味物质的生成[1]。因此，通过营养手段调控肠道微生物，从源头上减少臭气物质的生成对解决畜禽养殖臭气污染问题具有重要意义。
桑叶提取物(mulberry leaf extract，MLE)是以桑叶为原料，经干燥、粉碎、提取及喷雾干燥而成的粉状物质。桑叶经提取后能有效降低桑叶中的抗营养因子含量，并富含多糖、多酚、黄酮和生物碱等多种天然活性成分，具有抗炎、抗氧化、降糖和免疫调节的功效[3-4]。以往的研究结果表明，在饲粮中添加MLE能够提高蛋鸡、肉鸡和猪等畜禽的生产性能，并提高动物机体的抗氧化能力、免疫功能及肉品质等[5-8]。此外，桑叶及MLE还能调节肠道菌群平衡。研究表明，桑叶粉可改变鸡肠道的微生物组成[9]，桑叶水提物可改善肥胖大鼠脂肪代谢，增加粪便中变形杆菌、蓝藻菌和拟杆菌数量至正常水平[10]。然而MLE能否通过调节肠道微生物来减少粪便中臭气物质的生成，目前鲜有报道。因此，本试验以断奶仔猪作为研究对象，通过在饲粮中添加0.1%的MLE，探讨其对仔猪粪便中主要微生物数量以及臭气物质含量的影响，旨在为生猪生产过程中通过营养手段从源头减少粪便中臭气物质生成提供科学依据。
1.1 试验材料
本试验所用MLE是由桑叶粉的乙醇浸提物浓缩后喷雾干燥制成，由广州市某公司提供。其主要活性成分为桑叶黄酮、桑叶多酚、桑叶多糖和生物碱，其中桑叶总黄酮含量为20.51%。
1.2 试验设计
本试验设计同前期已发表文献[11]，即选取48头健康的“杜×长×大”三元杂交断奶阉公猪，初始体重为(8.287±0.141) kg，随机分为2组，每组6个重复(栏)，每个重复4头猪。根据NRC(2012)推荐的断奶仔猪营养需要量配制断奶前期(7～11 kg)和断奶后期(12～25 kg)2个阶段的玉米-豆粕型基础饲粮，其组成及营养水平见表1。对照组饲喂基础饲粮， MLE组在基础饲粮的基础上添加0.1%的MLE(产品企业标准制定前进行了梯度试验，推荐剂量为0.1%)。试验期28 d。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)
续表1项目 Items断奶前期(7～11 kg)Early weaning period (7 to 11 kg)断奶后期(12～25 kg)Late weaning period (12 to 25 kg)磷酸氢钙 CaHPO41.201.00石粉 Limestone0.650.65维生素-矿物质预混料 Vitamin-mineral premix1)0.500.50L-赖氨酸盐酸盐 L-Lys·HCl0.500.42L-苏氨酸 L-Thr0.300.16DL-蛋氨酸 DL-Met0.260.22L-色氨酸 L-Trp0.030.02合计 Total100.00100.00营养水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)14.8714.68粗蛋白质 CP20.0219.65钙 Ca0.810.74总磷 TP0.650.60有效磷 AP0.420.37赖氨酸 Lys1.401.31蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.740.68苏氨酸 Thr0.810.76色氨酸 Trp1.381.26
1.3 饲养管理
所有试验仔猪均饲养在同一全封闭式猪舍内，猪舍内温度控制在(25±1) ℃，相对湿度控制在(50±5)%。试验期间所有仔猪自由采食和饮水，每次喂食遵循少量多次原则。每天定时清扫猪舍，并观察仔猪的健康状况。定期对猪舍进行消毒，消毒及免疫程序均按照猪场常规程序进行。
1.4 样品采集
试验期最后3 d(第26～28天)，每天晨饲前进行粪样的收集，每栏至少收集3头断奶仔猪的新鲜粪样，混合后立即测定粪便pH，并以3 d的平均值作为每栏仔猪粪便的pH。然后在第28天的混合粪样中取100 g置于-80 ℃保存，用于粪便主要微生物数量及臭气物质含量等指标的检测。
1.5 指标测定
1.5.1 生长性能和腹泻率
试验开始和结束时对各组断奶仔猪进行空腹称重，试验期间记录断奶仔猪的采食量。试验结束后计算每栏断奶仔猪的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。每天早晚2次观察断奶仔猪的精神状态，并仔细检查其肛门及粪便情况，观察有无腹泻情况并记录。试验结束后，根据以下公式计算每栏仔猪的腹泻率：
腹泻率(%)=100×[仔猪腹泻头次总和/
(仔猪头数×试验天数)]。
1.5.2 粪便主要微生物数量的测定
采用SIMGEN粪便DNA纯化试剂盒(杭州新景生物试剂开发有限公司)提取粪便总DNA，操作步骤严格按照说明书进行。使用核酸蛋白检测仪Nanodrop 1100(Thermo Fisher Scientific，美国)测定总DNA浓度和纯度。采用Real-time PCR仪(CFX96 Real-time PCR System，Bio-Rad CFX Connect，美国)对粪便中的总菌、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、梭菌Ⅳ(Clostridiumcluster Ⅳ)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)和大肠杆菌(Escherichiacoli)的16S rRNA基因的拷贝数进行定量分析，引物序列参考Yu等[12]，见表2。参照Chen等[13]的方法，通过构建标准质粒建立特定的标准曲线。PCR反应体系及扩增程序参考文献[12]提供的方法。结果均计算为每克粪便中16S rRNA基因拷贝数的对数值，以lg(拷贝数/g)表示。
表2 微生物种类及其引物序列
1.5.3 粪便pH的测定
采用pH计(HI 9024C，HANNA Instruments，Woonsocket，美国)测定断奶仔猪粪便的pH。
1.5.4 粪便中乳酸含量的测定
粪便中乳酸的含量采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，按照说明书的步骤进行测定。
1.5.5 粪便中挥发性脂肪酸含量的测定
粪便中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸等的含量采用气相色谱仪(7890B，Agilent Technologies Inc，美国)进行测定，并计算总挥发性脂肪酸的含量。具体步骤参照Yu等[14]的方法。
1.5.6 粪便中氨态氮(NH3-N)含量的测定
采用靛蓝酚蓝分光光度法测定粪便中NH3-N含量，具体操作步骤参照蒲万霞等[15]的方法。
1.5.7 粪便中生物胺、酚和吲哚类物质含量的测定
采用高效液相色谱(HPLC)法测定断奶仔猪粪便中甲胺、色胺、酪胺、腐胺、尸胺、精胺和亚精胺的含量，然后计算总生物胺含量，具体操作步骤参照Yang等[16]的方法；
采用HPLC法测定粪便中酚和吲哚类物质主要检测甲酚、苯酚、吲哚和粪臭素的含量，具体操作步骤参照Jensen等[17]的方法。
1.6 数据处理
本试验中所有试验数据采用SPSS 23.0软件进行独立样本t检验(ttest)，试验结果用“平均值±标准误”(mean±SE)表示，0.05≤P<0.10时表示差异有显著趋势，P<0.05时表示差异显著，P<0.01时表示差异极显著。
2.1 MLE对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响
2组断奶仔猪的ADFI和F/G无显著差异(P>0.05)，但MLE组的ADG(0.350 kg)与对照组(0.316 kg)相比有提高的趋势(P=0.059)。此外，MLE组的腹泻率(1.464%)显著低于对照组(3.571%)(P<0.05)。详细结果请查阅前期已发表文献[11]。
2.2 MLE对断奶仔猪粪便主要微生物数量的影响
由图1可知，饲粮添加MLE对粪便中总菌、厚壁菌门和拟杆菌门的数量无显著影响(P>0.05)，但显著提高了粪便中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量(P<0.05)，显著降低了粪便中大肠杆菌的数量(P<0.05)。上述结果表明，MLE能够增加肠道中有益菌的数量，降低有害菌的数量，从而有助于维持肠道微生物的平衡状态。
2.3 MLE对断奶仔猪粪便pH及乳酸、挥发性脂肪酸含量的影响
由表3可知，与对照组相比，饲粮添加MLE后，断奶仔猪粪便pH有降低的趋势(P=0.061)，粪便中乳酸含量显著升高(P<0.05)；
此外，MLE组断奶仔猪粪便中乙酸、丙酸含量有升高的趋势(0.05≤P<0.10)，粪便中丁酸、戊酸和总挥发性脂肪酸含量显著提高(P<0.05)。
数据柱标记*表示差异显著(P<0.05)。
表3 MLE对断奶仔猪粪便pH及乳酸、挥发性脂肪酸含量的影响
2.4 MLE对断奶仔猪粪便中NH3-N含量的影响
由表4可知，与对照组相比，MLE组断奶仔猪粪便中NH3-N含量有降低的趋势(P=0.056)。
表4 MLE对断奶仔猪粪便中NH3-N含量的影响
2.5 MLE对断奶仔猪粪便中酚类和吲哚类物质含量的影响
由表5可知，2组断奶仔猪粪便中苯酚含量无显著差异(P>0.05)；
但与对照组相比，MLE组断奶仔猪粪便中对甲酚含量显著降低(P<0.05)，粪便中吲哚和粪臭素含量有降低的趋势(0.05≤P<0.10)。
表5 MLE对断奶仔猪粪便中酚类和吲哚类物质含量的影响
2.6 MLE对断奶仔猪粪便中生物胺含量的影响
由表6可知，与对照组相比，MLE组断奶仔猪粪便中尸胺、腐胺、组胺、色胺、酪胺和总生物胺含量显著降低(P<0.05)，粪便中精胺、亚精胺和甲胺含量无显著差异(P>0.05)。
表6 MLE对断奶仔猪粪便中生物胺含量的影响
3.1 MLE对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响
新鲜的桑叶难以消化，通常要经过微生物发酵来提高其消化率。然而，新鲜和发酵的桑叶中纤维素含量高，其添加量不能超过一定的阈值，这因此限制了其作为畜禽饲料添加剂的适用性[18]。此外，桑叶中还含有单宁、植物凝集素等抗营养因子，影响饲粮的适口性。研究表明，在生长育肥猪饲粮中添加发酵桑叶，猪的ADG随发酵桑叶添加比例的提高而出现显著下降[19]。因此，从桑叶中提取活性成分作为饲料添加剂效果会更好。MLE中含有的黄酮类化合物、多糖类、生物碱和甾醇类等多种天然活性物质，具有促进动物生长和提高免疫力等功能[3]。Zhao等[20]研究发现，饲粮添加桑叶多糖能够促进肠道微生态平衡，从而降低断奶仔猪的腹泻率，提高其生长性能。此外，有报道称，在饲粮中添加0.3%的MLE和杜仲提取物(MLE∶杜仲提取物=1∶1)能够提高育肥猪的生长性能，并改善其肉品质[7]。唐佳希等[8]研究表明，在生长猪饲粮中分别添加0.10%和0.15%MLE能够显著提高生长猪的ADFI和ADG。然而Chen等[18]研究发现，在断奶仔猪饲粮中添加150和300 g/t的MLE对断奶仔猪体重影响不大，但能显著降低断奶仔猪的腹泻率。MLE对猪生长性能的不同影响可能跟猪所处的生长阶段有关，对于断奶仔猪来说，仔猪腹泻是影响仔猪健康发育的重要原因。因此，降低腹泻对于提高断奶仔猪的机体健康意义重大。与Chen等[18]的研究结果相似，在本研究中，MLE组断奶仔猪ADG有升高的趋势，但其腹泻率显著降低，这可能跟MLE中的多种活性物质促进了有益菌的生长，改善了仔猪肠道微生态环境，促进了肠道健康，提高了机体抗氧化能力和免疫力有关。
3.2 MLE对断奶仔猪粪便微生物数量的影响
在本研究中，饲粮添加MLE能够增加断奶仔猪粪便中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量，降低大肠杆菌的数量。乳酸杆菌和双歧杆菌是常见的肠道益生菌，不仅能参与碳水化合物的发酵产生乳酸、乙酸和挥发性脂肪酸，还能产生抗菌因子，通过调节炎症因子的平衡和抑制有害菌的增殖，对维持肠道健康具有重要作用[21-22]。大肠杆菌是一种条件致病菌，也是一种含氮化合物降解菌，被认为是引起猪腹泻和胃肠道疾病的最常见原因[23]。与本研究结果相一致，邝哲师等[24]研究发现，饲粮中添加5%和10%桑叶粉能够降低肉鸡盲肠中大肠杆菌数量，增加有益菌的数量。另外，MLE的多种活性物质也均被报道对肠道菌群有类似的影响。Zhao等[20]研究发现，桑叶多糖能促进早期断奶仔猪肠道中乳酸杆菌和双歧杆菌的生长，同时抑制肠道中大肠杆菌的生长。Liao等[25]研究表明，MLE中的酚类物质和纤维能够提高乳酸菌等有益菌的数量，改善高脂饮食导致的大鼠肠道菌群多样性的下降。此外，体外试验结果也证实，MLE中的生物碱和黄酮类物质对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌等致病菌有较好的抑菌效果[26-27]。在本试验中，MLE能够促进断奶仔猪肠道中有益菌群的生长并抑制潜在病原菌的生长，从而改善肠道微生态，降低腹泻率。因此，推测MLE对粪便微生物的这种调控作用可能来源于MLE中桑叶多糖、酚类、生物碱和黄酮类等生物活性物质的影响。
3.3 MLE对断奶仔猪粪便pH及乳酸、挥发性脂肪酸含量的影响
粪便pH是肠道pH的反映。仔猪断奶时，其胃肠道尚未发育成熟，肠道微生物群落极易受周围环境等因素的影响而发生变化。断奶仔猪肠道pH升高会使大肠杆菌等有害菌大量繁殖，从而抑制乳酸杆菌等有益菌的生长，而低肠道pH环境则能抑制大肠杆菌等病原菌的繁殖，肠道中的微生物酶活性也会提高[28]。在本试验中，饲粮添加MLE后断奶仔猪的粪便pH有降低的趋势，这主要跟粪便中增加的乳酸和总挥发性脂肪酸含量有关。乳酸是由多种肠道细菌如乳酸杆菌和双歧杆菌在碳水化合物发酵过程中产生的代谢物。挥发性脂肪酸也称为短链脂肪酸，是肠道微生物发酵碳水化合物、膳食纤维和蛋白质而产生的一系列代谢物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和异丁酸。在本试验中，MLE提高了断奶仔猪粪便中乳酸、丁酸、戊酸以及总挥发性脂肪酸的含量，粪便中乙酸和丙酸的含量也有提高的趋势，表明MLE能够促进肠道中碳水化合物的发酵。由于挥发性脂肪酸的恶臭阈值远高于含氮化合物发酵产生的臭气物质，对动物机体的危害程度较小[29]。相反，肠道中产生的挥发性脂肪酸不仅有助于形成肠道酸性pH环境，还能通过多种途径影响宿主代谢，对动物肠道及机体的健康有着非常重要的作用[30-31]。因此，本试验结果表明，MLE能够通过促进乳酸杆菌和双歧杆菌等碳水化合物降解菌的增殖，提高肠道中乳酸和挥发性脂肪酸的含量，从而形成酸性pH环境，促进肠道中碳水化合物的发酵。
3.4 MLE对断奶仔猪粪便NH3-N、生物胺、酚类和吲哚类物质含量的影响
NH3-N、生物胺、酚类和吲哚类物质等是动物后肠中含氮化合物发酵产生的主要臭气物质，具有潜在毒性，不仅会促进肠道上皮细胞产生炎症反应，还可诱导致病菌增加，对动物肠道及机体健康产生不利影响[32-33]。NH3-N是氨基酸在肠道微生物作用下脱氨形成的代谢物[34]，极不稳定，容易转化为氨气释放到空气中。氨气的臭气检测阈值较低，猪群吸入后易患呼吸道病和眼病，抗病力降低，对动物机体产生较大危害[21,35]。生物胺是由相应氨基酸经脱羧反应生成的一类臭气物质[34]。研究表明，体内低浓度的生物胺对细胞生长和机体发育有益，但高浓度的生物胺会引起恶心、头痛、皮疹和血压变化等不良反应，危害动物的健康[36-38]。肠道微生物降解苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸产生一系列酚类和吲哚类臭气物质，主要包括苯酚、对甲酚、吲哚和粪臭素等，其臭气阈值均较低，具有强烈的恶臭味[39]。其中，吲哚和粪臭素(3-甲基吲哚)是色氨酸发酵产生的吲哚类物质，而苯酚、对甲酚则是酪氨酸发酵的主要产物[21]。在本试验中，MLE组断奶仔猪粪便中NH3-N的含量有降低的趋势，粪便中尸胺、腐胺、组胺、色胺、酪胺和总生物胺的含量以及对甲酚的含量显著降低，粪便中吲哚和粪臭素的含量也有降低的趋势。以上结果表明，饲粮添加MLE能够减少断奶仔猪后肠中含氮化合物的发酵，从而减少粪便中NH3-N、生物胺、酚类和吲哚类物质等臭气物质的生成和排放。本课题组前期研究发现，粪便中NH3-N、生物胺、酚类和吲哚类物质的含量与蛋白质降解菌大肠杆菌的数量呈正相关[40]。而在本试验中，断奶仔猪粪便中NH3-N、生物胺、酚类和吲哚类物质含量的降低也伴随着粪便中大肠杆菌数量的减少。此外，肠道pH是影响含氮化合物的主要环境参数之一。中性或微碱性的pH有利于含氮化合物的发酵，而酸性的肠道pH环境不仅能使细菌分泌的蛋白酶活性降低[41]，而且有利于乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌的繁殖，同时抑制大肠杆菌等有害菌的繁殖。因此，肠道中pH的降低减弱了细菌蛋白酶的活性，抑制大肠杆菌等蛋白质降解菌的繁殖，从而减少了后肠中含氮化合物的发酵，减少了NH3-N、生物胺、酚类和吲哚类化合物等臭气物质的产生。
饲粮添加MLE能够增加断奶仔猪粪便中碳水合物降解菌乳酸杆菌和双歧杆菌的数量，减少含氮化合物降解菌大肠杆菌的数量，从而降低断奶仔猪的腹泻率，提高粪便中乳酸及挥发性脂肪酸的含量，减少粪便中NH3-N、生物胺、吲哚和粪臭素等臭气物质的生成和排放。
猜你喜欢臭气吲哚桑叶发酵桑叶在动物生产中的应用四川蚕业(2022年1期)2022-06-06桑叶茶成“致富茶”今日农业(2021年21期)2021-11-26吲哚美辛肠溶Eudragit L 100-55聚合物纳米粒的制备山东第一医科大学(山东省医学科学院)学报(2021年7期)2021-10-13阳城：桑叶茶『火』了 农民乐了今日农业(2021年13期)2021-08-14HPV16E6与吲哚胺2，3-二氧化酶在宫颈病变组织中的表达昆明医科大学学报(2020年12期)2021-01-26宝贵的“臭气”第二课堂(课外活动版)(2021年7期)2021-01-18污水处理与固废处理行业臭气治理技术探讨云南化工(2020年11期)2021-01-14焦化厂污水处理站臭气治理的实践山东冶金(2019年3期)2019-07-10氧代吲哚啉在天然产物合成中的应用山东化工(2019年11期)2019-06-26吲哚胺2，3-双加氧酶在结核病诊断和治疗中的作用国际呼吸杂志(2019年1期)2019-03-08