范秋丽 谭淑君 李 辉 王君雁 茅沈丽 张 盛 陈志龙 蒋守群*
(1.广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广州510640；
2.广州立达尔生物科技股份有限公司，广州510663)
目前，饲用抗生素替代产品依然是畜牧行业的研究热点，且主要集中在天然植物提取物和微生态制剂等方面[1]。辣椒碱又名辣椒素，是一种从茄科植物中提取的香草酰胺类生物碱，含酚羟基结构，其因环保健康，且无副作用，是天然绿色替抗产品开发的热点之一[2]。研究表明，辣椒碱具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等生物学功能。1和2 g/L的辣椒碱可分别抑制体外培养下大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长[3]；
50 μmol/L辣椒碱可通过E2F通路下调细胞周期E蛋白和胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因和蛋白表达水平，从而抑制肺癌细胞的增殖[4]；
0.15 g/kg辣椒碱可修复高脂饮食饲喂大鼠引起的睾丸和肝脏氧化损伤[5]。在生产方面，辣椒碱已被证明可改善畜禽生长性能和肠道菌群结构，提高畜禽产品品质。饲粮添加1.2 g/d辣椒碱可提高泌乳前期奶牛瘤胃厚壁菌门相对丰度和代谢物万古霉素和维生素B6含量[6]；
饲粮添加300 mg/kg辣椒碱可提高樱桃谷肉鸭生长性能和腿肌中抗氧化酶活性，同时提高胸肌红度值，降低滴水损失和蒸煮损失[7]。虽然也有学者研究发现，饲粮添加0.05%的液体蛋氨酸和2.5 mg/kg辣椒碱可提高1～38日龄肉鸡平均日增重[8]；
饲粮添加75 mg/kg辣椒碱可提高42日龄肉鸡肠道消化酶活性、肉品质和免疫器官指数[9]，但天然辣椒碱对肉鸡肠道营养物质转运载体相关基因表达量和肠道微生物群落结构的影响研究目前尚无报道。基于此，本试验研究基础饲粮中添加不同水平的辣椒碱对818肉鸡生长性能、血浆生化指标、肠道消化酶活性、肠道营养物质转运载体相关基因mRNA表达量和盲肠微生物的影响，并与抗生素作比较，为其在肉鸡健康养殖中的应用提供参考依据。
1.1 试验材料
1日龄818肉鸡公雏购自广东某食品集团有限公司；
恩拉霉素购自河南某生物科技有限公司，有效成分含量4%；
辣椒碱为天然提取物，有效成分含量0.5%，由广州某生物科技股份有限公司提供。
1.2 试验设计
试验选用600只初始体重为(38.15±0.01) g且健康状况良好的1日龄818肉鸡公雏，根据体重一致原则随机分为4个组，每组6个重复，每个重复25只。对照组饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加500 mg/kg恩拉霉素(抗生素组)、180 mg/kg辣椒碱(辣椒碱Ⅰ组)和360 mg/kg辣椒碱(辣椒碱Ⅱ组)的饲粮。试验期40 d。
1.3 试验饲粮
试验采用玉米-豆粕型基础饲粮，根据《中国饲料成分及营养价值表(2020年第31版)》和《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制，各组饲粮营养水平保持一致，基础饲粮组成及营养水平见表1。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)
续表1项目 Items1～21日龄1 to 21 days of age22～40日龄22 to 40 days of age总磷 TP0.640.60非植酸磷 NPP0.450.40
1.4 饲养管理
试验于2022年2月19日至2022年3月30日在广东省农业科学院动物科学研究所试验场开展，试鸡平养于封闭式鸡舍，地面铺放谷壳，自由采食颗粒饲料和饮水，各组饲养管理和环境条件一致，每天自然通风，保持鸡舍内清洁卫生。按照常规饲养操作和免疫程序进行饲养和免疫。
1.5 样品的采集与制备
试验结束时，每重复挑选接近平均体重的2只鸡翅静脉采集全血4 mL于含有肝素钠的抗凝管中，3 500 r/min离心10 min后取上清血浆分装，于-80 ℃保存备测血浆生化指标；
采血后的试鸡颈部放血致死，采集空肠食糜于灭菌的2 mL离心管中，于-20 ℃保存备测食糜消化酶活性；
空肠肠段取中间部位10 cm部分，剪开后用生理盐水冲洗干净后分装于2 mL无核糖核酸酶(RNase)的离心管中，于-80 ℃保存备测营养物质转运载体相关基因mRNA表达量；
采集盲肠内容物于灭菌的5 mL离心管中，于-80 ℃保存备测菌群相对丰度。
1.6 测定指标及方法
1.6.1 生长性能
肉鸡不同生长阶段结束前1天19:00断料供水，次日07:00以重复为单位称重，统计采食量，各生长性能指标测定参考范秋丽等[10]的方法。
1.6.2 血浆生化指标
采用多功能酶标仪(SYNERGY H1，BioTek公司，美国)测定血浆总蛋白(TP)、葡萄糖(GLU)、尿酸(UA)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量，测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；
采用双抗夹心法测定血浆胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)和5-羟色胺(5-HT)含量，测定试剂盒均购自北京方程生物科技有限公司；
血浆丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)含量以及总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)参考Wang等[11]的方法测定。以上所有指标检测步骤和结果计算均按照试剂盒说明书进行。
1.6.3 空肠食糜消化酶活性
10%空肠食糜匀浆液制备方法和二喹啉甲酸(BCA)含量测定均参考范秋丽等[10]的空肠匀浆液制备和测定方法。采用比色法测定空肠食糜胰蛋白酶(trypsin)、α-淀粉酶(AMS)和脂肪酶(LPS)活性，测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，各指标检测步骤和结果计算严格按照说明书进行。
1.6.4 营养物质转运载体相关基因mRNA表达量
空肠组织RNA的提取、核酸浓度检测、cDNA反转录、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测和结果计算均参考Ruan等[12]的方法。引物设计使用Primer Premier 3.0软件，按照GenBank中鸡的引物序列(表2)设计全部引物。
表2 实时荧光定量PCR引物序列
1.6.5 盲肠微生物属水平相对丰度
盲肠微生物DNA提取、纯度检测、16S rDNA V3～V4可变区PCR扩增、凝胶产物回收、文库构建、测序、物种注释以及微生物属水平相对丰度分析均参考范秋丽等[13]的方法进行。
1.7 数据统计分析
试验数据采用SPSS 21.0软件中的one-way ANOVA程序进行单因素方差分析，当处理效应差异显著时进行Duncan氏法多重比较，P<0.05为差异显著性判断标准，结果均以平均值和均值标准误(SEM)表示。
2.1 辣椒碱对1～40日龄818肉鸡生长性能的影响
由表3可知，1～21日龄，与对照组相比，抗生素组、辣椒碱Ⅰ组和辣椒碱Ⅱ组肉鸡21日龄体重和平均日增重均显著提高(P<0.05)，料重比显著降低(P<0.05)，其中21日龄体重分别提高了13.42%、13.52%和14.03%(P<0.05)，平均日增重分别提高了14.92%、14.98%和15.59%(P<0.05)，同时料重比分别降低了6.36%、7.51%和6.94%(P<0.05)。22～40日龄，与对照组相比，辣椒碱Ⅰ组肉鸡40日龄体重显著提高了10.02%(P<0.05)。1～40日龄，与对照组相比，抗生素组、辣椒碱Ⅰ组和辣椒碱Ⅱ组肉鸡平均日增重和平均日采食量均显著提高(P<0.05)，其中平均日增重分别提高了6.01%、10.36%和6.18%(P<0.05)，平均日采食量分别提高了4.86%、5.80%和5.28%(P<0.05)。
表3 辣椒碱对1～40日龄818肉鸡生长性能的影响
2.2 辣椒碱对818肉鸡血浆生化指标的影响
由表4可知，与对照组相比，抗生素组、辣椒碱Ⅰ组和辣椒碱Ⅱ组肉鸡血浆TP含量均显著提高(P<0.05)；
辣椒碱Ⅰ组血浆GLU、UA和MDA含量均显著降低(P<0.05)，且血浆MDA含量显著低于抗生素组(P<0.05)；
同时，辣椒碱Ⅰ组血浆T4和GSH含量显著提高(P<0.05)，且血浆GSH含量显著高于抗生素组(P<0.05)。不同组之间肉鸡血浆TG、TC、IGF-1、T3、5-HT含量以及T-SOD活性和T-AOC均无显著差异(P>0.05)。
表4 辣椒碱对818肉鸡血浆生化指标的影响
2.3 辣椒碱对818肉鸡空肠食糜消化酶活性的影响
由表5可知，与对照组相比，辣椒碱Ⅰ组肉鸡空肠食糜中胰蛋白酶和脂肪酶活性均显著提高(P<0.05)，且空肠食糜中脂肪酶活性显著高于抗生素组(P<0.05)。不同组之间肉鸡空肠食糜中淀粉酶活性无显著差异(P>0.05)。
表5 辣椒碱对818肉鸡空肠食糜消化酶活性的影响
2.4 辣椒碱对818肉鸡空肠营养物质转运载体相关基因mRNA表达量的影响
由表6可知，与对照组相比，辣椒碱Ⅰ组和辣椒碱Ⅱ组肉鸡空肠小肽转运载体1(PepT1)和B0系统中性氨基酸转运载体(B0AT)mRNA表达量均显著提高(P<0.05)，且辣椒碱Ⅰ组显著高于抗生素组(P<0.05)。不同组之间肉鸡空肠葡萄糖转运蛋白2(GLU2)、兴奋性氨基酸转运载体3(EAAT3)和大型中性氨基酸转运蛋白1(LAT1)mRNA表达量均无显著差异(P>0.05)。
表6 辣椒碱对818肉鸡空肠营养物质转运载体相关基因mRNA表达量的影响
2.5 辣椒碱对818肉鸡盲肠微生物属水平相对丰度的影响
表7展示了肉鸡盲肠微生物属水平相对丰度大于1%的微生物。由表可知，与对照组相比，辣椒碱Ⅰ组肉鸡盲肠中拟杆菌属(Bacteroides)和粪杆菌属(Faecalibacterium)相对丰度均显著提高(P<0.05)，盲肠中另枝菌属(Alistipes)相对丰度显著降低(P<0.05)。不同组之间肉鸡盲肠中肠球菌属(Enterococcus)、布劳特氏菌属(Blautia)和巴恩斯氏菌属(Barnesiella)相对丰度均无显著差异(P>0.05)。
表7 辣椒碱对818肉鸡盲肠微生物属水平相对丰度的影响
3.1 辣椒碱对肉鸡生长性能的影响
研究表明，辣椒碱可激活包括采食调节神经在内的全身副交感神经，通过提高采食量达到增加体增重的效果[14]。袁杨斌等[7]研究表明，300 mg/kg辣椒碱能够显著提高樱桃谷肉鸭15～42日龄和1～42日龄平均日增重和平均日采食量。Liu等[9]研究发现，基础饲粮中添加80 mg/kg辣椒碱可提高爱拔益加(AA)肉鸡1～21日龄、22～42日龄和1～42平均日增重。本研究结果显示，饲粮添加180和360 mg/kg辣椒碱均可显著提高818肉鸡21日龄体重、1～21日龄和1～40日龄平均日增重以及1～40日龄平均日采食量，且达到添加抗生素水平，此结果与前人研究结果相似；
此外，饲粮添加辣椒碱显著降低了1～21日龄料重比，这与钟金凤等[15]研究的饲粮添加10 mg/kg辣椒碱可显著降低湘黄肉鸡1～42日龄料重比的结果一致，同时也与本课题组前期应用75 mg/kg辣椒碱降低了2～42日龄817肉鸡料重比的结果[16]一致，这表明不同添加水平的辣椒碱均可提高1～40日龄818肉鸡生长性能，降低饲料成本。
3.2 辣椒碱对肉鸡血浆生化指标的影响
良好的内环境是畜禽进行正常物质代谢的基础，血液生化指标则可反映机体内环境的状态。血浆TP含量升高、UA含量降低，说明机体蛋白质合成和氮的利用能力均增强[17]。本研究结果显示，饲粮添加抗生素和不同水平辣椒碱均可显著提高肉鸡血浆TP含量，同时180 mg/kg辣椒碱显著降低了肉鸡血浆UA含量，这与Liu等[9]应用80 mg/kg辣椒碱降低了42日龄肉鸡血清尿素氮(UN)含量结果相似。GLU是机体重要的能量来源，研究表明，肉鸭采食量增加的原因与辣椒碱降低血液GLU含量有关[7]。朱靖等[6]研究发现，饲喂泌乳前奶牛1.2 g/d辣椒碱60 d后可降低血清GLU含量。袁杨斌等[7]研究也发现，300 mg/kg辣椒碱可显著降低14日龄樱桃谷肉鸭血清GLU含量。本研究表明，180 mg/kg辣椒碱可显著降低40日龄818肉鸡血浆GLU含量，与前人研究结果一致。机体所释放的甲状腺激素中90%以上为T4，因而测定血液中T4含量能有效评估甲状腺功能状态，T4含量升高，营养物质代谢增强，能够促进生长发育[18]。本研究结果表明，180 mg/kg辣椒碱可提高818肉鸡血浆T4含量，这也与此水平辣椒碱显著提高肉鸡40日龄体重的结果一致。MDA含量降低，GSH含量升高，表明机体抗氧化能力增强[19]。Liu等[9]研究发现，80 mg/kg辣椒碱可通过提高肉鸡血清T-SOD活性和T-AOC达到提高抗氧化能力的目的，虽然本研究结果中不同添加水平的辣椒碱对肉鸡血浆T-SOD活性和T-AOC无显著影响，但180 mg/kg辣椒碱可显著降低血浆MDA含量，同时显著提高血浆GSH含量，这与张月等[20]研究发现辣椒碱中的酚羟基可降低自由基活性，减少脂质过氧化物生成的结果一致。
3.3 辣椒碱对肉鸡肠道消化酶活性的影响
胃肠道消化酶活性的高低可作为评估机体对营养物质消化吸收的关键指标，胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶分别在分解饲粮中碱性氨基酸、碳水化合物和脂肪时发挥了重要的作用[21-22]。研究表明，辣椒碱可同时刺激内源性胆囊收缩和内、外源性胰腺增长，从而提高胰腺的分泌以及消化酶活性[23]。本研究结果发现，180 mg/kg辣椒碱可同时提高肉鸡空肠食糜中胰蛋白酶和脂肪酶活性，此结果与Liu等[9]应用80 mg/kg辣椒碱提高肉鸡胰腺中胰蛋白酶和脂肪酶活性的结果相似，也与Platel等[24]应用1.5 mg/kg辣椒碱提高维斯塔鼠胰腺中胰蛋白酶和脂肪酶活性的结果相似，这表明饲粮添加180 mg/kg辣椒碱可通过提高肠道消化酶活性促进肠道对营养物质的消化吸收。
3.4 辣椒碱对肉鸡营养物质转运载体相关基因mRNA表达量的影响
肉鸡饲粮蛋白质在肠道内的主要消化产物为寡肽和氨基酸，而这两者的吸收又依靠肠上皮细胞细胞刷状缘膜和基底膜上的寡肽转运载体和各种氨基酸转运载体来协同完成，其中PepT1、B0AT和EAAT3在分别在转运二肽、三肽、大型脂肪族氨基酸以及天冬氨酸和谷氨酸中发挥了重要的作用[25-28]。PepT1和B0AT表达量升高，表明肠道对营养物质的转运和吸收增强[29]。本研究结果显示，饲粮添加180和360 mg/kg辣椒碱均可显著上调818肉鸡空肠PepT1和B0ATmRNA表达量，这表明辣椒碱的添加可通过提高肠道营养物质转运载体相关基因的表达促进肉鸡肠道对营养物质的转运和吸收。
3.5 辣椒碱对肉鸡盲肠微生物的影响
肠道菌群在机体对抗疾病过程中起到了重要的防御作用，且肉鸡盲肠内微生物最为密集[30]。研究表明，酚类化合物可通过影响胃肠道优势菌群相对丰度提高机体对能量的利用[31]，因此，研究辣椒碱对肉鸡盲肠微生物属水平相对丰度也可反映辣椒碱对胃肠道健康的影响。拟杆菌属可降解植物多糖，通过在肠道中产生乙酸和丙酸等短链脂肪酸提高肠道代谢功能[32]。粪杆菌属产生的丁酸盐不仅能够协调机体对抗外来病原菌的入侵，而且可通过上调抗菌肽的表达降低机体炎症反应，提高免疫功能[33]。另枝菌属为拟杆菌门中的一种，是重要的肠道菌属，与肠道炎症密切相关[34]。本研究结果显示，180 mg/kg辣椒碱可显著提高肉鸡盲肠微生物拟杆菌属和粪杆菌属相对丰度，同时降低另枝菌属相对丰度，该结果与本课题组前期应用酚类化合物没食子酸降低黄羽肉鸡盲肠微生物另枝菌属相对丰度的结果[13]相似，这表明饲粮添加180 mg/kg辣椒碱可通过提高肠道有益菌群相对丰度和减少有害菌群相对丰度调节肠道健康。
① 基础饲粮中添加180和360 mg/kg辣椒碱均可改善1～40日龄818肉鸡生长性能；
② 180 mg/kg辣椒碱可提高818肉鸡糖代谢、氮代谢和抗氧化能力，提高肠道消化酶活性、营养物质转运载体相关基因mRNA表达量和有益菌群相对丰度；
③ 180 mg/kg辣椒碱可替代抗生素添加于818肉鸡基础饲粮中。
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