郑园园，杨延超，李清扬，赵宝华
（河北师范大学生命科学学院，河北石家庄 050700）
传染性造血器官坏死病（infectious hematopoietic necrosis，IHN）是由传染性造血器官坏死病病毒（infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）引起的一种主要感染鲑、鳟等冷水鱼类的全身性急性传染病[1]，世界动物卫生组织（WOAH）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为二类动物疫病[2]。自20世纪80年代在我国辽宁省本溪市首次报告该病以来，该病传播范围不断扩大，对大型鱼类的致死率达30%，其中对幼鱼的致死率高达100%，造成极大的经济损失，严重威胁我国鲑鱼养殖业的健康发展[3-4]。目前对于IHNV尚没有特定的治疗方法，较为常用的预防措施是接种疫苗[5]。相较于传统灭活疫苗或减毒疫苗，亚单位疫苗具有更好的安全性和稳定性，因此开发或研制高效的抗IHNV抗原及亚单位疫苗对水产养殖业的可持续发展至关重要。
IHNV是一种线性单股负链RNA病毒，属弹状病毒科（Rhabdoviridae），其编码的蛋白质包括聚合酶蛋白L（polymerase）、非病毒结构蛋白NV（non-virion protein）、糖蛋白G（glycoprotein）、基质蛋白M（matrix）、磷酸化蛋白P（phosphoprotein）以及核衣壳蛋白N（nucleprotein）[6]。其中，基质蛋白M大小为21～32 kDa，是病毒基因组中最小的一种多功能蛋白，其L区通过与宿主蛋白相互作用介导病毒的组装和出芽。该蛋白对病毒的致病性极为关键[7]。更有研究[8]表明，用重组IHNV-M蛋白接种虹鳟鱼，可使其产生高水平的特异性IgM抗体，以抵抗IHNV的感染，因而基质蛋白M有望成为抗IHNV疫苗研制的新抗原。因此，对IHNV-M蛋白可溶性表达的研究显得尤为重要，这将为IHNV-M蛋白疫苗的成功研制奠定基础。
M蛋白是IHNV内部结构蛋白，其疏水性远大于亲水性，因此M蛋白往往以包涵体的形式表达[9]。要恢复蛋白生物活性，包涵体蛋白必须经过十分复杂的变性、复性操作，而且其复性效率较低，这大大增加了外源蛋白在大肠杆菌体系中的制备难度[10]。朱玲等[11]将pET-32a用于M蛋白表达系统，虽实现了目的蛋白的大量表达，但复性剂浓度的突变影响了活性蛋白回收效率，降低了目的蛋白含量。为克服上述不足，本研究利用麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein，MBP）与IHNV-M蛋白融合表达高效获得了重组MBP-M蛋白。其中，MBP被认为是一种“保持酶”，它通过阻止融合蛋白的聚集而起到促使目标蛋白高效可溶性表达的作用。因此，就提高融合蛋白的溶解性而言，MBP标签是最佳选择[12]。更有研究[13]显示，MBP标签对外源蛋白的生物活性或结构影响最小，可增强融合蛋白的免疫反应。目前MBP标签已在一些疏水性蛋白的重组表达中得以应用。例如，有研究[14]将人黏蛋白1（MUC1）与MBP融合表达，获得了高纯度的可溶性MUC1-MBP蛋白，其可诱导T细胞应答且具有较强的免疫原性。
本研究采用MBP标签与IHNV-M蛋白融合表达策略，通过构建重组菌株pMAL-c2x-m/BL21（DE3），致力于实现IHNV-M在大肠杆菌BL21（DE3）中的可溶性表达，并纯化出可溶性目的蛋白，分析检测其免疫学活性，为抗IHNV-M亚单位疫苗研制提供基础。
1.1 材料与试剂
大肠杆菌DH5α、BL21（DE3），购自博迈德生物技术有限公司；
原核表达载体pMAL-c2x，保存于本实验室；
BCA蛋白浓度测定试剂盒、2×Super Pfx MasterMix，购自康为世纪试剂有限公司；
质粒提取试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；
限制性内切酶（EcoRI、BamHI、T4 DNA），购自TaKaRa生物公司；
DNA凝胶回收试剂盒，购自北京天根生物有限科技公司；
SDSPAGE凝胶快速制备试剂盒，购自上海雅酶生物科技有限公司；
MBP标签兔单克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG及HRP山羊抗鼠IgG，均购自Immunoway Biotechnology 公司；
MBP预装柱，购自NEB公司。
1.2 试验动物
4～5周龄雄性BALB/c小鼠，购自恒容生物科技（天津）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 引物设计与合成 根据GenBank中IHNVm基因序列（登录号：AB231685），利用Primer 5.0软件设计引物，并在引物两端分别加上酶切位点EcoRI和BamHI的碱基序列（表1下划线所示），由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
表1 PCR扩增引物序列
1.3.2 目的基因获取 IHNVm基因由安徽通用生物有限公司合成，以合成的基因为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：2×super pfx MasterMix 25.0 µL，上游引物和下游引物各2.5 µL（10 µmol/L），模板1.0 µL，ddH2O补足至50.0 µL。PCR反应条件：98 ℃预变性3 min；
98 ℃变性10 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；
72 ℃终延伸5 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的基因备用。
1.3.3 重组表达载体pMAL-c2x-m构建 将回收的目的基因和pMAL-c2x质粒双酶切，使其分别具有相同的EcoRI、BamHI酶切位点。酶切产物切胶回收后加入T4 DNA连接酶连接，连接产物转入DH5α，进行菌落PCR验证。将阳性转化子送至金唯智基因公司测序鉴定。将测序正确的阳性转化子转入表达宿主BL21（DE3）中，进行菌落PCR验证，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.3.4 MBP-M 融合蛋白初步诱导表达及SDSPAGE分析鉴定 将重组菌株pMAL-c2x-m/BL21、转化空质粒的BL21（DE3），用接种环挑取单克隆转入10 mL LB（含Amp）液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养过夜；
次日取1 mL菌液于100 mL LB（含Amp）液体培养基中，培养菌液D600nm约为0.6时，将菌液分装至50 mL锥形瓶中各25 mL，加入终浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L的IPTG，16 ℃诱导表达20 h；
将诱导后的菌液离心收集菌体，并将菌体重新悬浮在10 mL重悬裂解液（10 mmol/L的Tris-HCl，0.1%的巯基还原剂，pH 8.0）中，超声裂解30 min；
向分别取得的裂解液上清、裂解液沉淀中加入4×SDS上样缓冲液，煮沸10 min后，用10%的SDS-PAGE进行分析。
1.3.5 MBP-M融合蛋白表达条件优化 因大肠杆菌表达系统缺陷，其表达的蛋白通常易形成不溶性的包涵体，且不溶性蛋白活性较可溶性蛋白活性低，因此为提高MBP-M融合蛋白在上清的表达量，对诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间进行了一定优化。取1.5 mL活化好的重组菌液于150 mL LB（含Amp）液体培养基中，培养菌液D600nm约为 0.6时，将菌液分装到50 mL锥形瓶中各25 mL，加入终浓度为0.5 mmol/L IPTG。将分装的菌液按照不同温度在摇床振荡一定时间。当温度为20、25 ℃时，分别振荡12、20 h；
当温度为30 ℃时，分别振荡6、12 h；
将诱导后的菌液离心，用重悬裂解液重悬并超声裂解，分别取裂解液上清、裂解液沉淀制样，最后进行SDS-PAGE分析。
1.3.6 MBP-M 融合蛋白纯化 以1%的比例将活化的重组菌液扩培到100 mL LB（含 Amp）液体培养基中，25 ℃、160 r/min 培养12 h，离心收集菌体；
用10 mL重悬裂解液重悬后超声破碎30 min，离心收集上清，用麦芽糖结合预装柱纯化。利用洗涤缓冲液（10 mmol/L的Tris-HCl，0.1%的Triton100，pH 8.0）去除杂蛋白，收集流穿液；
通过洗脱缓冲液（10 mmol/L的Tris-HCl，10 mmol/L麦芽糖，pH 8.0）洗脱并收集目的蛋白。利用SDS-PAGE分析目的蛋白纯度，利用BCA（Bicinchoninic acid）法检测其浓度。
1.3.7 MBP-M融合蛋白鉴定
1.3.7.1 Western blot验证 将纯化的MBP-M融合蛋白及MBP标签蛋白通过SDS-PAGE电泳后，转印到硝酸纤维素膜上，加封闭液（1×TBST，5%脱脂奶粉），4 ℃封闭过夜；
用1×TBST洗涤4次后，加入1:10 000稀释的兔抗MBP标签，室温孵育2 h；
洗涤后，加入1:15 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG，室温孵育1 h；
利用1×TBST 洗涤4次，每次5 min，加入显色液显色分析。
1.3.7.2 DDA鉴定 利用DDA（data dependent acquisition）对融合蛋白一级质谱中丰度最高的子离子进行采集、检测[15]，将结果与MBP-M融合蛋白的多肽序列进行比对、分析。
1.3.8 动物免疫与鼠抗血清制备 取健康BALB/c小鼠16 只，随机分成4组，每组4只，分别为MBP-M融合蛋白免疫组、MBP蛋白免疫组、PBS对照组、正常组。上述纯化的蛋白与弗氏完全佐剂或非完全佐剂混合后得到稳定的油包水乳剂，将其免疫BALB/c小鼠，注射抗原（MBP-M融合蛋白、MBP蛋白、PBS）梯度分别为50、100、150、200 µg/只，完全佐剂或非完全佐剂与注射抗原体积比为1:1。免疫时间为1～4周，共4次，初免采用弗氏完全佐剂，初免后为弗氏非完全佐剂。每次于小鼠腹股沟皮下注射相应抗原和佐剂，最后一次免疫后7 d进行眼球取血，离心取上层血清，-20 ℃保存备用。
1.3.9 MBP-M融合蛋白免疫原性检测及效价
1.3.9.1 Western blot检测 将MBP-M融合蛋白、MBP蛋白样品进行SDS-PAGE，以PBS为对照组，将其转印到硝酸纤维素膜上，将制得的鼠抗血清以封闭液1:5 000稀释后作为一抗，以封闭液1:15 000稀释的 HRP山羊抗鼠IgG为二抗，经显色液显色后分析，检测鼠抗血清的反应原性。
1.3.9.2 效价测定 将MBP-M融合蛋白稀释至25 mg/L，100 µL/孔加入酶标板，37 ℃包被过夜；
1×TBST洗涤后，加封闭液，37 ℃封闭2 h；
洗涤后，待检血清用封闭液稀释加入96孔板，稀释倍数依次为1 600、3 200、6 400、12 800、25 600、51 200、102 400、204 800倍，37 ℃孵1 h，PBS组为对照组；
洗涤后，加入二抗，100 µL/孔，37 ℃孵育1 h；
加入显色液TMB，100 µL/孔，37 ℃避光 孵育15 min；
加2 mol/L H2SO4终止液，50 µL/孔；
最后酶标仪检测样品D450nm值，若P/N≥2.1为阳性。
2.1 pMAL-c2x-m重组质粒构建
经凝胶电泳分析PCR扩增得到的单一DNA条带，片段大小约600 bp，与预期结果相符（图1-A）。将pMAL-c2x-m重组质粒转化至大肠杆菌BL21，对其进行PCR验证，并用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，发现目的条带大小约为600 bp（图1-B），与IHNVm基因大小一致，将验证正确的菌株命名为pMAL-c2x-m/BL21。
图1 IHNV m基因PCR扩增及pMAL-c2x-m重组质粒的PCR验证结果
2.2 MBP-M融合蛋白初步诱导表达
将构建好的重组菌pMAL-c2x-m/BL21在16 ℃，IPTG终浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L条件下，诱导20 h，对照为转化空质粒的BL21。SDS-PAGE电泳分析结果（图2）显示，MBP-M融合蛋白以可溶形式存在于细胞裂解液上清中，随着IPTG浓度的升高，目的蛋白表达量逐渐增加，当IPTG 浓度为0.5 mmol/L 时，目的蛋白在上清的表达量较高，因此选用0.5 mmol/L IPTG诱导蛋白表达。
图2 MBP-M 融合蛋白的初步诱导表达结果
2.3 MBP-M融合蛋白表达条件优化
取不同诱导条件下的细胞破碎液上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。结果（图3）显示：当D600nm=0.6，诱导温度为25 ℃，诱导时间为12 h时，MBP-M融合蛋白在上清的表达量较高，因此将其作为最佳诱导条件。
图3 不同诱导条件样品的SDS-PAGE电泳分析结果
2.4 MBP-M融合蛋白纯化
重组菌pMAL-c2x-m/BL21按照优化的条件诱导表达，收集菌体并超声破碎，利用MBP亲和层析柱纯化收集上清，通过SDS-PAGE对流穿、洗涤和洗脱的蛋白进行分析。结果（图4）显示，在64 kDa处成功表达了与预期相对分子质量一致的MBP-M融合蛋白。
图4 MBP-M 融合蛋白的纯化结果
2.5 MBP-M融合蛋白鉴定
2.5.1 Western blot分析 将纯化的MBP-M及MBP蛋白进行SDS-PAGE后，经Western blot分析。结果显示：MBP-M融合蛋白在64 kDa处有特异性条带，表明其表达成功，且与抗MBP标签具有良好的反应原性（图5-A）；
MBP蛋白相对分子质量大小约50 kDa，同样与抗MBP标签有良好免疫反应（图5-B）。
图5 纯化MBP-M及MBP蛋白的Western blot分析结果
2.5.2 DDA比对分析 通过对MBP-M融合蛋白的多肽序列比对，发现约90%为目的蛋白MBP-M（图6）。
图6 纯化后MBP-M融合蛋白多肽的序列对比结果
2.6 MBP-M融合蛋白免疫原性及效价检测
2.6.1 Western blot检测 经Western blot分析，鼠抗血清与MBP-M融合蛋白、MBP蛋白在相应位置出现特异性条带，而与PBS反应则未出现条带（图7），表明纯化的MBP-M融合蛋白诱发机体产生了良好的免疫反应。
图7 MBP-M融合蛋白Western blot（阳性血清）鉴定结果
2.6.2 效价检测 通过间接ELISA法检测BALB/c小鼠4次免疫后的血清效价，发现鼠抗血清效价可达 1:25 600（图8）。
图8 鼠抗MBP-M融合蛋白血清效价测定结果
IHNV毒力强、传播快，严重威胁着鲑鱼水产养殖业健康发展。而研发具有较强免疫原性的亚单位疫苗是阻断该病毒传播的有效手段[16]。相较于核酸疫苗和病毒载体疫苗而言，去除病原核酸及其有害成分的亚单位疫苗，避免了抗原间的竞争，免疫效果强，安全性高。研究[17]表明，IHNV-M 蛋白可下调病毒的复制，抑制相关免疫基因的表达水平，对病毒的致病力有重要影响。因此M蛋白可作为抗IHNV亚单位疫苗的候选靶抗原。但目前，通过原核表达获得的M蛋白多以包涵体形式存在，大多数包涵体蛋白经复性后对其功能造成一定影响[18]。
本研究利用大肠杆菌MBP融合表达了纯度大于90%的MBP-M 融合蛋白。此外，通过优化诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间，提高了蛋白表达量和可溶性表达比例。用纯化后的MBP-M蛋白联合佐剂免疫小鼠，通过对免疫后产生的特异性鼠抗血清分析，发现IHNV-M蛋白具有较好的免疫原性。因此，本研究获得的MBP-M蛋白具有可溶性表达量高、免疫原性强、纯化难度低等优点。
综上所述，本研究解决了M蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达的难题，实现了IHNV-M的可溶性高效表达，且获得的MBP-M融合蛋白具有较强免疫原性，为开发新型抗IHNV亚单位疫苗提供了理论依据和数据支撑。
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