郭文娜，姚亚丽，张彦婷，关方霞
郑州大学生命科学学院 郑州 450001
黑色素瘤是一种源于黑色素细胞的恶性肿瘤，其发病率在全球范围内持续上升[1-4]。在中国，黑色素瘤每年增加约2万例[5-7]。黑色素瘤临床发现较晚，恶性程度高，具有高度的侵袭性，预后较差，严重影响人类健康[8]。阐明黑色素瘤发生发展的分子机制，探究有效的治疗分子靶点具有重要意义。Kelch样(Kelch-like，KLHL)家族基因突变可导致机体发生多种疾病：如KLHL6基因突变可导致慢性淋巴细胞白血病的发生[9]；
KLHL5 mRNA在胃癌中表达上调，与患者淋巴结分期、浸润水平和预后较差相关[10]；
KLHL13是肺癌恶性进展的重要因素[11]；
KLHL19基因突变与肝癌、胆囊癌[12]以及非小细胞肺癌[13]的发生密切相关。KLHL21与Cullin3的相互作用对HeLa细胞的有丝分裂具有调节作用，与其他家族成员不同的是，KLHL21在细胞分裂后期开始时调控染色体乘客复合体易位，这是完成细胞分裂所必需的[14]；
KLHL21在肝癌的发生及进展中至关重要，下调KLHL21可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭[15-16]；
我们的前期研究[17]发现KLHL21 cg06778853(chr1:6612560)位点的甲基化与黑色素瘤预后显著相关，然而，KLHL21在黑色素瘤中的生物学功能尚不明确。为此，作者进行了如下研究，探究KLHL21在黑色素瘤细胞增殖、迁移及免疫浸润中的作用及其潜在的分子机制。
1.1 细胞培养及分组人黑色素瘤A375细胞系购自上海酶研生物科技有限公司，正常人永生角质形成细胞Hacat购自中国科学院细胞库。细胞用含体积分数10% 胎牛血清的MEM培养基、于含体积分数5% CO2的37 ℃恒温培养箱中培养，每2 d传代1次。传代3次后，将细胞分为3组：正常对照组、siNC组(转染阴性对照siRNA)和siKLHL21组(转染KLHL21特异性siRNA)。KLHL21特异性siRNA由上海吉玛制药有限公司设计并合成，序列为5’-CGUCCAUGAAUCAGGUACATT-3’。将细胞接种在6孔板中过夜，通过Lipofectamine 2000试剂(美国Invitrogen公司)将siRNA(浓度为50 nmol/L)转染入细胞。转染6 h收集细胞用于后续实验。
1.2 细胞中KLHL21 mRNA表达的qRT-PCR检测使用TRIzol(美国Invitrogen公司)试剂从A375、Hacat及3组A375细胞中提取总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]合成cDNA。在LightCycler 480 Ⅱ实时PCR系统(瑞士罗氏公司)上使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(日本TaKaRa生物技术公司)进行qRT-PCR。以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参，采用2-ΔΔCt计算目的基因的表达量。实验重复3次。
1.3 细胞中KLHL21 蛋白表达的Western blot检测根据组织蛋白提取试剂盒说明书使用RIPA裂解缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)提取A375、Hacat及3组A375细胞总蛋白，并进行Western blot检测。KLHL21 抗体为兔抗人多克隆抗体(英国 Abcam公司，按稀1∶1 000释度) ，内参为β-actin抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)。采用 Image J进行条带灰度分析，以目的蛋白与 β-actin 条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。实验重复3次。
1.4 细胞增殖活性的CCK-8法和EdU法检测
① 3组细胞接种到96孔板中，每孔约3 500个，分别在37 ℃、体积分数 5% CO2及饱和湿度条件下培养24、48和72 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于细胞培养箱中继续培养2 h。在微孔板读取器上测量450 nm波长处的吸光度(A)，计算细胞增殖率。细胞增殖率=[(A实验孔-A空白孔)/(A阴性对照-A空白孔)]×100%。实验重复3次。
② 参照EdU检测试剂盒(广州锐博生物科技有限公司)说明书将细胞在含有50 μmol/L EdU的培养基中培养2 h，然后对细胞进行染色，并使用倒置荧光显微镜采集左上、左下、右上、右下及中间5个视野(×200)，计数EdU阳性细胞(红色)，计算细胞增殖率。细胞增殖率=EdU阳性细胞/总细胞数×100%。实验重复3次。
1.5 细胞迁移能力的Transwell小室检测将Transwell小室放置于24 孔板中，下室加600 μL含体积分数20%胎牛血清的培养基。取对数生长期的细胞，用无血清培养基重悬，调整细胞密度为 3×105个/mL。将细胞悬液加入上室。培养36 h，用棉签擦去上室中的细胞后，使用40 g/L多聚甲醛将小室底部细胞固定15 min，结晶紫溶液避光染色15 min，室温下干燥，最后在倒置显微镜下拍摄图像，选取5个视野(×400)进行细胞计数(取5个视野的均数)。实验重复3次。
1.6 KLHL21表达水平与免疫细胞浸润水平的相关性分析从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)下载458例黑色素瘤患者的RNA-seq数据，利用TIME分析黑色素瘤患者中KLHL21表达水平与免疫细胞浸润水平的关系。同时，根据文献报道[18-21]，选择黑色素瘤治疗中常用的8个免疫检查点抑制剂相关基因，应用Spearman相关性分析其与KLHL21表达水平的相关性。
1.7 统计学处理采用 R 4.0.3和GraphPad Prism 8.01进行数据分析。应用t检验分析A375和Hacat细胞中KLHL21 mRNA和蛋白表达的差异。应用单因素方差分析和LSD-t检验比较3组A375细胞中KLHL21 mRNA和蛋白表达水平、细胞增殖率和细胞迁移数的差异。检验水准α=0.05。
2.1 黑色素瘤细胞中KLHL21 mRNA和蛋白的表达结果见图1。由图1可知，A375细胞中KLHL21 mRNA和蛋白的表达量[(4.18±0.30)、(2.92±0.07)]高于正常细胞Hacat[(1.00±0.01)和(1.00±0.01)](t=15.840和50.260，P<0.001)。
图1 A375和Hacat细胞中 KLHL21蛋白表达的Western blot检测
2.2 沉默KLHL21对A375细胞中KLHL21 mRNA和蛋白表达水平、细胞增殖和迁移的影响结果见表1。由表1可知，siKLHL21组KLHL21的mRNA和蛋白表达水平均低于正常对照组及siNC组 (P<0.001)。
CCK-8实验结果表明，相较于siNC组，KLHL21表达下调导致A375细胞在24、48和72 h的生长水平降低(图2)。
EdU分析显示，相较于正常对照组，siNC组的细胞增殖率和细胞迁移量无明显变化，而siKLHL21组的细胞增殖率和细胞迁移数降低(表2、图3)。
表1 3组细胞中siRNA干扰效率的比较
图2 3组A375细胞的增殖曲线(CCK-8法)
表2 3组细胞增殖率与迁移数的比较
2.3 KLHL21与黑色素瘤组织免疫浸润水平的关系Spearman相关性分析显示：黑色素瘤中KLHL21与CD4+T细胞浸润水平呈负相关(P<0.05)，与CD8+T细胞、树突细胞浸润水平呈正相关(P<0.001，图4)，表明KLHL21和免疫环境之间存在潜在联系。KLHL21与PD-1、PD-L2、CTLA4、CD4、CD8A和CD80等免疫检查点抑制剂相关基因的表达呈负相关(P<0.05)(图5)。
图4 KLHL21表达水平与黑色素瘤免疫细胞浸润水平的相关性
图5 KLHL21表达水平与免疫检查点抑制剂相关基因的相关性
黑色素瘤是最致命的皮肤癌，通常患者诊断时已是晚期，预后不佳[8]。尽管近年来对黑色素瘤进行了数项研究，但其潜在的分子机制仍不清楚。KLHL 家族蛋白在癌症发生发展中有着非常重要的功能[9]。KLHL21在肝癌[16]、乳腺癌[22]、胆管癌[23]等的发生进展中起重要作用，但KLHL21在黑色素瘤中的生物学功能尚不明确。因此，本研究基于分子实验结合生物信息学分析探究了KLHL21在黑色素瘤细胞增殖和迁移中的作用及其与免疫细胞浸润性以及免疫检查点抑制剂相关基因的相关性。
通过分子实验分析，本研究发现KLHL21在黑色素瘤A375细胞中高表达，特异性抑制其表达可以降低黑色素瘤细胞的增殖、迁移，说明KLHL21可能在黑色素瘤的发生发展中起着重要作用。
目前，免疫治疗是晚期或转移性黑色素瘤患者的首选治疗方法，以免疫检查点抑制剂为首的免疫治疗可显著降低死亡及复发风险，延长患者生存期[18]。本研究发现KLHL21表达水平与CD4+T细胞免疫浸润水平呈负相关，与CD8+T细胞、树突细胞呈正相关。CD4+T细胞是人体免疫系统中一种重要的免疫细胞，CD8+T细胞分泌的各种细胞因子参与免疫作用，对肿瘤细胞具有杀伤作用，是机体抗肿瘤机制的重要环节。树突细胞是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，能有效激活初始T细胞，维持免疫应答的中心环节[24]。同时，我们发现KLHL21表达水平与免疫检查点抑制剂相关基因PD-1、PD-L2、CTLA4、CD4、CD80等的表达水平呈负相关。抗PD-1和抗CTLA4免疫治疗能抑制肿瘤进展，改善患者预后[25-26]。这些结果说明KLHL21可能在黑色素瘤的发生发展、免疫治疗及靶向治疗中起重要作用。
综上所述，KLHL21在黑色素瘤细胞A375中显著上调，抑制KLHL21表达可诱导黑色素瘤细胞凋亡、抑制细胞的增殖和迁移。KLHL21与免疫浸润性细胞及免疫检查点抑制剂相关基因相关。尽管KLHL21在黑色素瘤发生和发展中的具体作用及相关机制仍需要进一步研究，但我们相信在完善相关基础及临床试验后，KLHL21将有望成为黑色素瘤治疗的新靶点，改善黑色素瘤患者的预后。
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