杨 志，杨名龙，王 宇，孙玉林，李冠宗，王 康，杨福梅，代飞燕*
（ 1. 云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201 ；
2. 大理市动物疫病预防控制中心，云南 大理 671003 ；
3. 昆明市官渡区动物疫病预防控制中心，云南 昆明 650214 ；
4. 昆明市技术合同认定登记站，云南 昆明 650021 ；
5. 华中农业大学动物科学技术学院，湖北 武汉 430070 ）
蜡状芽孢杆菌是一种分布广泛、好氧、喜中温、产芽孢的革兰氏阳性杆菌，常见于土壤、空气、水中，耐受性强，能够在恶劣环境中生存[1]，易污染谷类、粉状食品、马铃薯泥、乳及乳制品[2-3]。蜡状芽孢杆菌可产生多种不同的肠毒素，包括溶血素、非溶血性的肠毒素、细胞毒素等，可导致腹痛、严重腹泻[4]。在许多国家，由蜡状芽孢杆菌引起的、较为严重的食物中毒事件早已有报道，中毒者表现呕吐、腹泻等症状[5]。国内也有研究报道了蜡状芽孢杆菌引起伤口感染、食物中毒，甚至是肺炎及败血病的情况。蜡状芽孢杆菌感染家畜还会引起牛乳房炎和子宫内膜炎、马表皮溃烂、猪腹泻等疾病[6-8]。也有研究表明，蜡状芽孢杆菌感染可能会导致牛猝死[9]，还可引起人类的眼疾、败血症和心脑膜炎等疾病[10]。本文报道了一例蜡状芽孢杆菌引起蓝黄金刚鹦鹉反复腹泻且难以治愈病例的诊疗经过，为相关疾病的临床诊治提供参考。
1.1 病料采集
昆明市某鹦鹉观赏园中的一个鹦鹉群出现不同程度的腹泻情况，发病鹦鹉排白色、绿色稀粪或水样粪便，采取治疗后病情依旧反复，无法痊愈。
其中一只黄蓝金刚鹦鹉腹泻程度尤为严重，采食量严重下降、被毛脏乱、精神沉郁、排绿色水样粪便、机体逐渐消瘦。按照无菌采样要求，采集该患病黄蓝金刚鹦鹉泄殖腔棉拭子，进行细菌培养分离鉴定。
1.2 试验材料
试验仪器：生化恒温培养箱（上海恒科科技有限公司）、水浴恒温振荡器（金坛杰瑞尔电器有限公司）、PCR仪（Bio-Rad公司）。
培养基与试剂：胰酪大豆培养基（TSA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、哥伦比亚血琼脂平板、DL2000 DNA Marker，购自生工生物工程（上海）股份有限公司，药敏片和微量生化反应管购自杭州滨和微生物试剂有限公司，Premix Taq（TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye）购自宝日医生物技术（北京）有限公司，FinePure 通用型基因组柱式提取试剂盒购自济凡生物科技（北京）有限公司。
1.3 细菌分离培养
在生物安全柜内用接种环将病料接种至TSB 培养基中，37 ℃、120 r/min增菌培养18～24 h。采用三区画线法接种TSB 增菌液到TSA 培养基上培养，37 ℃恒温培养24～36 h，观察生长情况。挑取优势单菌落接种到TSB培养基中，37 ℃、120 r/min 纯化培养24 h，血琼脂培养基上37 ℃恒温培养24 h，观察生长形态和菌落形态。
1.4 生化鉴定试验
将分离菌株接种于微生物微量生化鉴定管，按照说明书要求进行操作，对各项生化指标进行鉴定，并参照《常见细菌系统鉴定手册》[11]进行判定。
1.5 16S rRNA鉴定
将分离菌株采用济凡细菌基因组DNA 提取试剂盒，并根据试剂盒说明书步骤提取该细菌菌株的核酸。采用细菌通用引物进行PCR扩增，所得PCR产物送至上海生工生物工程有限公司昆明分公司进行基因测序。
1.6 药敏试验
采用标准纸片法（K-B 法）进行药敏试验。菌液吸取200 μL注入MH琼脂培养基，用无菌的三角棒将菌液均匀涂布在MH琼脂培养基上，复方新诺明、阿米卡星、卡那霉素等抗生素贴片完成后，将平板倒置在37 ℃恒温培养箱中培养24 h，测量抑菌圈直径，统计结果。
2.1 细菌分离培养及染色镜检结果（见图1、图2）
由图1可知，TSA 培养基上可见中间厚边缘薄、白色、圆形的中等大小菌落。菌落在哥伦比亚血琼脂平板上生长良好，菌落形态呈白色圆形、表面光滑、中间隆起、边缘整齐，出现明显的β溶血现象。
图1 血平板菌落形态Fig.1 Morphology of colony on blood plate
由图2可知，菌液纯化涂片进行革兰氏染色镜检，镜检结果为革兰氏阳性杆菌。
图2 菌株染色镜检结果Fig.2 Results of microscopic examination of isolated strains
2.2 生化鉴定结果（见表1）
由表1 可知，分离株与标准菌株蜡状芽孢杆菌基本一致，初步鉴定所分离目标菌株为蜡状芽孢杆菌。
表1 生化鉴定结果Tab.1 Biochemical identification results
2.3 16S rRNA鉴定结果（见图3）
由图3 可知，分离菌株采用通用引物进行PCR 扩增，扩增结果显示目的条带为1 500 bp，与预期结果相同。
图3 分离菌株PCR电泳结果Fig.3 PCR electrophoresis of isolated strains
分离菌株基因序列经NCBI 数据库比对，结果显示与蜡状芽孢杆菌B4同源性为99.86%。
2.4 药敏试验结果
按标准纸片对分离株进行药敏试验，结果显示，分离菌株对复方新诺明、阿米卡星、卡那霉素、磺胺异亚唑、多西环素、诺氟沙星、头孢哌酮、头孢拉定、阿莫西林等9种抗生素均表现耐药。
2.5 治疗
首先清理鹦鹉舍内的粪便污物，鹦鹉舍、食槽、水槽、活动院落清理干净后用过氧乙酸喷洒消毒，地面用3%火碱进行彻底消毒。防鼠防鸟，避免与野鸟接触；
加强饲养管理，禁止饲喂霉变污染饲料，科学搭配饲料，补充维生素及各种矿物质添加剂。
根据临床症状及药敏试验结果，采用中药组方F1 进行治疗。F1 组成：夏枯草5 g，菊花5 g，白芍10 g，党参15 g，茯苓15 g，山药15 g，白术15 g，黄芪10 g，补骨脂20 g，打粉120 目过筛。患病鹦鹉5 g/（只·d），同群轻微或无症状鹦鹉2 g/（只·d），拌料混匀，每天两次随料饲喂，连用7 d，之后药量减半再喂7 d。
采用上述处方投喂3 d 后，患病黄蓝金刚鹦鹉腹泻情况好转，粪便开始成形，为稀粥样粪便，排便次数及绿色粪便减少；
同群其他重症鹦鹉情况也出现好转，轻微症状的鹦鹉停止腹泻，粪便逐渐趋于正常，未出现新增病例；
全群鹦鹉精神状态及采食情况好转。投喂7 d 后，全群鹦鹉采食量、精神状态以及粪便形态、次数均恢复正常。14 d后，鹦鹉群内未出现再次腹泻的情况。
本研究从黄蓝金刚鹦鹉腹泻粪便中分离到1株具有溶血性的革兰阳性短杆菌，经生化鉴定及16S rRNA 基于测序比对，最终确定该菌株为蜡状芽孢杆菌。有文献报道，蜡状芽孢杆菌对头孢拉定、头孢哌酮、阿米卡星等抗生素敏感[12-13]。但本研究所分离的该鹦鹉源性蜡状芽孢杆菌菌株B4 对所使用的复方新诺明、阿米卡星、卡那霉素、磺胺异亚唑、多西环素、诺氟沙星、头孢哌酮、头孢拉定、阿莫西林等9 种抗生素均不敏感，对治疗用药造成极大难度。究其原因可能是该患病鹦鹉尿酸盐变绿，反复腹泻，时间长达两个多月，在此期间因疑是绿脓杆菌感染采用了大剂量的多种抗生素轮换治疗，也使用了益生菌进行胃肠调理，症状并未得到改善。长期大量抗生素使用，不仅会导致肠道菌群紊乱、胃肠功能下降，也使菌株对抗生素敏感性降低，导致本研究分离到的菌株对多种抗生素产生了耐药性。由此可见，随着抗生素广泛应用，细菌耐药性问题日益突出，而现在的化学药抗生素相对匮乏，众多学者将目光投向了来源广、安全性高、毒副作用小或无毒副作用的中草药。中草药含有多种混合成分，如氨基酸、多糖、多种维生素等，不仅能够调节体内微生物菌群、抗菌消炎等作用，而且不会导致细菌产生耐药性[14-15]。
肠毒素是引起食源性疾病的主要毒素，蜡状芽孢杆菌所产生的腹泻型肠毒素主要分为3 类：溶血性肠毒素（Hbl）、非溶血性肠毒素（Nhe）与细胞毒素（K）[16]，其中Hbl与Nhe毒素为引起腹泻的主要毒素。Hbl对细胞的破坏主要针对细胞膜，通过L1、L2及B亚基依次与细胞膜进行结合，溶解结合部位的细胞膜，形成孔洞，从而破坏细胞膜。Nhe 蛋白由NheA、NheB、NheC 等3 种蛋白亚基组成，Nhe亚蛋白释放到菌体外后，NheB与NheC进行组装形成寡聚体，在NheC单体诱导下，宿主细胞膜表面受体与寡聚体中的NheB结合，之后NheA与寡聚体结合形成复合体使细胞膜产生孔洞，导致胞内离子外流，最终致使细胞在胶体渗透作用下溶解死亡。蜡状芽孢杆菌感染鹦鹉机体，菌体增殖产生肠毒素，在肠毒素Hbl和Nhe的作用下，导致严重腹泻。使用抗生素可在一定程度上杀灭细菌，但毒素对机体的损伤却很难修复，从而出现反复腹泻，机体功能下降。
由该患病鹦鹉感染的蜡状芽孢杆菌菌株药敏试验结果可知，常用抗生素均耐药或无效，根据其病史和久泄不止的症状特征分析，病位在脾胃和大肠，属脾胃虚弱之象。病因多由肝木乘脾土、脾肾阳虚而起，因此，治疗以健脾益气、柔肝清肝散结、助阳为原则，选用党参、茯苓、白术、山药、黄芪健脾益气，白芍柔肝，夏枯草、菊花清热散结消肿，补骨脂补肾助阳，进行全面调理。
综上所述，在久泄鹦鹉的临床治疗过程中，以中医辨证论治，准确辨证为基础，选择相应的药物组方进行治疗，取得了良好效果，为该类疾病的临床治疗提供了新的思路和参考。
根据鹦鹉临床症状及细菌分离鉴定诊断，该鹦鹉群腹泻是由蜡状芽孢杆菌感染引起。采用自拟复方中药拌料投喂治疗7 d后患病鹦鹉临床症状消失，饮食、精神状况逐渐恢复正常。试验结果可为鹦鹉同类疾病的临床治疗提供新思路和参考。
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