宋晓龙 宋 峻 潘仁友 王 蕾 孙伟新 袁春玲
（1.南京中医药大学盐城附属医院，江苏省盐城市中医院，江苏 盐城 224000；
2.徐州医科大学，江苏 徐州 221000）
心血管疾病最终的病理变化最常见的是心肌纤维化，心脏成纤维细胞过度增殖，细胞外基质蛋白过度沉积，心脏间质的重塑是其主要特点［1］。在心脏间质的重塑过程中，心血管病变导致心室大小、结构和形态等发生较明显的变化，并伴随着心肌成纤维细胞的异常增殖，胶原的形成增多和降解减少，从而引起胶原蛋白的过度沉积［2］。心肌纤维化的形成导致心肌组织的顺应性下降，影响心脏的供血等功能。心肌纤维化与心肌梗死、心衰等心血管疾病密切相关，如不及时治疗，会导致心功能不全及休克猝死等，所以对于心肌纤维化的治疗是目前的研究重点［3-4］。全国名老中医曾学文教授在长期临床实践中提出心血管疾病的证治规律，即心气虚-心血瘀-心水肿-心厥脱（简称心脏病气血水厥说）的观点［5］，临床经验证实利心水方对慢性心力衰竭有着显著的临床疗效。但是利心水方对于治疗心力衰竭的内在机制，尤其是对心肌纤维的作用尚不明确。因此，本课题组制备大鼠的心肌纤维化模型，运用利心水方进行体内干预，观察对心肌纤维化的作用，现报告如下。
1.1 实验动物
SPF级雄性SD大鼠，6～7周龄，体质量180～220 g，由上海杰思捷实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（沪）2018-0004。实验均按照实验动物护理和使用指南进行，经江苏医药职业学院动物实验伦理委员会批准（XMLL-2021-880）。
1.2 实验药物
利心水方：猪苓30 g，人参10 g，白术10 g，黄芪40 g，制附子10 g，玉竹12 g，桂枝10 g，当归10 g，川芎10 g，葶苈子30 g，泽泻30 g。加水煎煮两次，第1次加10倍量水，浸泡1 h，加热煎煮60 min，过滤；
第2次继续加10倍量水，加热煎煮40 min，过滤。合并两次滤液，最终浓缩为生药含量2 g/mL的药液。
1.3 试剂及仪器
Trizol（Invitrogen公司，货号：15596018）；
Real Time PCR 试剂盒（诺唯赞公司，货号：R222-01）；
Anti-CollagenⅠ抗体（Abcam公司，货号：ab34710）；
Anti-α-SMA抗体（Abcam公司，货号：ab32575）；
Anti-TGF-β抗体（Abcam公司，货号：ab92486）；
Anti-Fibronectin抗体（Abcam公司，货号：ab268021）。显微镜（OLYMPUS，型号：IX51）；
超净工作台（苏州净化，型号：SWCJ-1D）；
qPCR荧光定量系统（杭州博日，型号：FQD-96A）；
PCR仪（Eppendorf，型号：6311000070）；
紫外分光光度计（ThermoFish，型号：SMA2000）；
高速冷冻离心机（DragonLab，型号：LR5K001727）；
恒温金属浴（上海一恒科技，型号：TU-100）。
1.4 分组与造模
50只SD健康大鼠分为5组：假手术组、模型组和利心水方低剂量组、中剂量组、高剂量组。除假手术组外，剩余4组大鼠均采用缩窄腹主动脉的方法构建慢性心力衰竭（CHF）模型［6］。腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，沿肋弓处沿前正中线切开腹部皮肤，长约2.5 cm，继之打开腹腔分离腹主动脉，平行于腹主动脉放置7号手术针，后用0号丝线绕手术针结扎，取出手术针，确定腹主动脉畅通，最后关腹。假手术组大鼠不结扎腹主动脉只分离。术后第5周末测定大鼠心脏左室舒张末压（LVEDP），以LVEDP≥15 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa）为心肌纤维化模型成功的标准。
1.5 干预方法
利心水方的剂量根据人-鼠剂量的换算公式［大鼠剂量（mg/kg）=W×人剂量（mg/kg），其中W为换算系数6.25］进行选择［7］。建模成功后，利心水方各剂量组分别以低（5 mL/kg）、中（15 mL/kg）、高剂量（25 mL/kg）的利心水方药液灌胃，假手术组和模型组予以相同体积的生理盐水灌胃，每日1次，连续喂药5周。
1.6 观察指标
1.6.1 超声心动图评估大鼠的心脏功能 末次给药24 h后，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，对其进行胸前备皮，调整仪器探头及调节参数，记录不同组别大鼠的左室舒张末期内径（LVEDD）和左室收缩末期内径（LVESD），并记录左室短轴缩短率（FS）和射血分数（EF）值。
1.6.2 HE染色 用4%多聚甲醛固定液灌注大鼠，取出心脏，30%蔗糖脱水24 h，OCT包埋，做冰冻切片，厚度10 μm，随即进行HE染色，镜下观察不同组别大鼠的心肌组织变化。
1.6.3 Masson染色 心肌组织按常规包埋、切片，先用苏木素染核15 min，接着盐酸酒精分色1～2 s，自来水蓝化20 min后丽春红染色20 min，用双蒸水快速洗1遍，亮绿染色3～5 s，最后双蒸水漂洗脱水，脱水后的切片用中性树胶封片，显微镜下观察。
1.6.4 RT-qPCR 检测 CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin mRNA的表达 Trizol法提取总RNA，利用核酸蛋白仪检测RNA浓度和纯度。每组各取1 μg RNA进行逆转录反应，按试剂盒说明书配制反应体系，42℃ 30 min，95℃ 5 min。以β-actin为内参，利用实时定量PCR仪，采用SYBR染料法进行实时定量PCR反应，基因引物参照GeneBank基因序列设计。引物序列见表1。
表1 引物序列
1.6.5 Western blotting法检测 CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白表达 提取心肌组织细胞蛋白质，利用二辛可宁酸法测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入稀释好的一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤液洗涤3次，加入二抗，室温孵育1 h，TBST洗涤液洗涤3次，化学发光后采集图像，并用软件对反应条带进行灰度分析，各蛋白相对表达量以各蛋白密度单位β-actin密度单位表示。
1.7 统计学处理
应用SPSS25.0统计软件。计量资料以（）表示。多组间比较以单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 各组大鼠心脏彩超结果比较
见表2。与假手术组比较，模型组大鼠LVEDD和LVESD明显增加，FS和EF数值较假手术组明显降低（P＜0.01），利用不同剂量的利心水方干预后，大鼠LVEDD和LVESD较模型组显著下降，随着剂量升高，差异越显著，而利心水方组大鼠FS和EF较模型组显著升高，同样，随着剂量升高，差异越显著（P＜0.05或P＜0.01）。
表2 各组大鼠心脏彩超结果比较（±s）
表2 各组大鼠心脏彩超结果比较（±s）
注：与假手术组比较，**P＜0.01；
与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；
与低剂量组比较，$P＜0.05，$$P＜0.01。下同。
组别假手术组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n 3 3 3 3 3 EF（%）86.29±2.74 37.92±2.59**45.39±2.95#55.11±2.87##$$68.88±1.59##$$FS（%）57.34±2.04 18.96±2.14**25.43±1.92#35.49±1.72##$$42.52±2.43##$$LVEDD（mm）4.97±0.22 8.87±0.27**7.87±0.26##7.10±0.13##$6.21±0.22##$$LVESD（mm）2.24±0.30 4.51±0.27**4.03±0.15 3.31±0.20##$2.86±0.17##$$
2.2 各组大鼠心肌组织的病理变化
HE染色示：假手术组大鼠的心肌细胞排列整齐，生长均一，细胞间隙小，而模型组大鼠的心肌细胞排列紊乱，细胞变大，间隙也明显增大，同时可见比较明显的心肌纤维化病灶的形成。与模型组相比，利心水方组大鼠的心肌细胞排列较为整齐，细胞间隙较小。见图1。
图1 各组大鼠心肌组织的病理变化（HE染色，200倍）
2.3 各组大鼠心肌胶原表达比较
Masson染色示：假手术组中大鼠的心肌细胞及其周围未发现明显胶原纤维沉积；
而模型组大鼠心肌细胞和血管周围能观察到大量蓝色的胶原纤维的沉积；
与模型组的大鼠心肌组织相比，利心水方各组大鼠的心肌细胞胶原纤维的沉积显著减少，高剂量组心肌细胞只有少量胶原纤维沉积。见图2。
图2 各组大鼠心肌胶原表达（Masson染色，200倍）
2.4 各组大鼠心肌组织CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin mRNA表达比较
见表3。与假手术组的大鼠相比，模型组大鼠心肌组织的Collagen I、α-SMA、TGF-β、FibronectinmRNA的表达水平显著升高（P＜0.01），利心水方组干预后，与模型组相比，心肌组织CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin的mRNA水平显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。
表3 各组大鼠心肌组织CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin mRNA表达比较（±s）
表3 各组大鼠心肌组织CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin mRNA表达比较（±s）
组别假手术组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n 3 3 3 3 3 Collagen I 1.00±0.06 2.15±0.06**1.71±0.09##1.38±0.07##$$1.11±0.07##$$α-SMA 1.00±0.07 3.10±0.09**2.43±0.11##2.12±0.09##$1.64±0.08##$$TGF-β 1.00±0.07 2.85±0.13**2.29±0.15##2.09±0.08##1.53±0.06##$$Fibronectin 1.00±0.10 3.22±0.09**2.64±0.08##2.39±0.09##$1.85±0.08##$$
2.5 各组大鼠心肌组织CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白表达比较
见表4、图3。与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），利心水方组干预后，心肌组织CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin的蛋白水平表达显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。
表4 各组大鼠心肌组织CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白表达比较（±s）
表4 各组大鼠心肌组织CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白表达比较（±s）
组别假手术组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n 3 3 3 3 3 CollagenⅠ1.00±0.21 4.20±0.33**3.27±0.30##2.47±0.27##$1.55±0.09##$$α-SMA 1.00±0.14 4.58±0.33**3.54±0.21#2.84±0.45##2.03±0.30##$$TGF-β 1.00±0.07 4.18±0.29**3.47±0.25#2.68±0.21##$2.07±0.26##$$Fibronectin 1.00±0.13 4.52±0.40**3.58±0.20##2.79±0.16##$2.15±0.32##$$
图3 各组大鼠心肌组织CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白条带
心肌纤维化是心脏受到多种病理因素影响所致，心肌成纤维化细胞过度增殖，细胞外基质胶原蛋白等过度沉积，进一步形成心肌纤维化，影响心脏功能［8］。有文献研究表明，心肌细胞受损时，缺少血氧，血液动力超负荷，促发心肌及间质细胞的相关基因表达，分泌多种活性细胞因子和生长因子，通过自分泌、旁分泌、血液循环、信号转导等作用，诱导心肌成纤维细胞活化增殖。临床上关于心肌纤维化的具体途径和机制尚不清楚，但已有研究报道，TGF-β1、氧化应激、炎症因子等参与了心肌纤维化的发生［9-10］。目前对中药复方治疗心肌纤维化的临床作用受到重视，本团队临床研究表明，利心水方Ⅱ能够明显改善慢性心力衰竭患者心功能状态，对改善心室重构有重要作用［11］。另外，笔者先前研究发现利心水方可以改善冠心病心力衰竭患者的临床症状和心功能，并对心肌纤维化有一定作用，能改善心肌重构［12］。利心水方对于心肌纤维的作用机制尚不完全明确。因此，本课题组利用大鼠的心肌纤维化模型研究利心水方体内干预下对心肌纤维化的作用，为临床用药提供基础研究。
与之前研究结果相似，超声心动图检测发现利心水方可显著改善心脏功能。HE染色和Masson染色实验结果表明，利心水方组中大鼠心肌细胞排列更为整齐，细胞间隙也较小，心肌细胞胶原纤维的沉积显著减少。由此可见，中药复方利心水方对于大鼠的心肌纤维化具有一定的保护作用，可在一定程度上减少胶原的沉积。与模型组相比，利心水方干预组心肌组织有一定程度的恢复。利心水方由人参、黄芪、玉竹、桂枝、制附子、当归、川芎、白术、葶苈子、猪苓、泽泻等组成，具有益气温阳、化瘀行水的功效。有研究发现运用温阳化饮、益气活血法干预急性心肌梗死早期左室重构大鼠，其血清肾素、AngⅡ、ALD含量明显下降，证实中药通过抑制RAAS激活降低心肌纤维化程度［13］，这与笔者的研究结果相似。
心脏成纤维细胞不仅可以分泌细胞外基质，也可以发挥降解细胞外基质的作用，从而保持正常心脏功能所必需的细胞外基质的平衡［14］。在疾病状态下，各种刺激损伤因素（如炎症细胞浸润、细胞因子、缺氧及高血糖等）均能诱导成纤维细胞活化增殖，转化为肌成纤维细胞，其高表达α-SMA。肌成纤维细胞会分泌大量细胞外基质波形蛋白、纤连蛋白和Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原等［15-16］。TGF-β/Smad信号通路是调节细胞外基质产生和心肌组织纤维化的关键信号通路［17］。在其他脏器的纤维化（肺纤维化和肝纤维化）中，均可见相关信号通路的活化，表明TGF-β在组织器官的纤维化中发挥着重要作用［18-21］。
本研究通过RT-qPCR和Western blotting实验检测了各组CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin的表达用以研究利心水方对心肌纤维化的作用。结果表明,心肌组织中CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin的mRNA及蛋白表达水平均显著下降，进一步证实了利心水方对心肌纤维化具有保护作用。综上所述，中药复方利心水方对于大鼠的心肌纤维化有一定的保护作用。
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