闫晓宁，李承睿
（1渭南职业技术学院，陕西渭南 714000；
2 杭州娃哈哈启力食品集团有限公司，陕西渭南 714000）
三唑类杀菌剂是主链上含有羟基（酮基）、取代苯基和1,2,4-三唑基化合物，为全球杀菌剂类别中品种最多的一个大类，三唑类杀菌剂与其他类型的杀菌剂的作用机制是不一样的，它主要是阻碍真菌麦角甾醇的生物合成，从而影响真菌细胞膜的结构与功能，导致菌体生长停滞甚至死亡[1]。同时，三唑类杀菌剂的作用机制和作用位点相对单一，长期频繁使用容易引起抗性。例如在晚稻病害防治时，人们容易三唑类杀菌剂超剂量施用，不仅不利于水稻生长，还容易引起水体污染，进而在动物体内富集。这种杀菌剂一旦在人体内富集会对分泌系统产生干扰影响，表现为神经系统的损害、机体的生殖机能下降、生物体的免疫能力降低以及诱发肿瘤等[2]。这种不良影响危害引发了人们对其残留量超标的关注度，尤其是食品和饲料中三唑类农药残留的检测成为了人们重点管控的关口。目前，对于三唑类杀菌剂的检测方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法(GS)、气质联用法(GC-MS)以及液质联用法（LC-MS）等。王颜红等[3]以MAA为单体，制备了阿特拉津MIP作为固相萃取填料，应用于农药残留的检测，检测回收率为90%。符瑞益等[4]采用液相色谱法以甲醇-水为流动相，测定三唑醇和腈菌唑的含量，检测的相对标准偏差均小于4.5%，加标回收率良好。乔鲁芹等[5]利用HPLC测定板栗中戊唑醇和咪酰胺的残留，其中咪酰胺的回收率大于80%，RSD小于11.3%，满足检测需求。吴文镶等[6]研究了模板物质与功能单体的结合方式，考察了模板物质的识别能力。对于三唑类杀菌剂残留的检测还存在一些亟待解决的问题，如杀菌剂残留痕量、基质的干扰以及同分异构体的分离等问题[7-8],而分子印迹材料结合液相色谱法具有材料制备简单、分析效率高、重现性好等优点，可以更加高效地分析杀菌剂残留。本文制备了联苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇分子印迹聚合物，其具有特异性选择、可反复使用、分离净化简单等特点，通过色谱条件优化，建立同时检测这3种三唑类杀菌剂残留的方法，这可以对国家农产品中该类农药的残留检测提供技术支持。
1.1 仪器
LC-1260Ⅱ型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；
UV-9000S型可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；
JM-16D-40型超声波清洗机，深圳市洁盟清洗设备有限公司；
RC-FA-324C型电子分析天平，北京睿诚永创科技有限公司；
R-300型高真空旋转蒸发仪，瑞士BUCHI公司。
1.2 试剂
联苯三唑醇（分析标准品，纯度>99%），上海江莱生物科技有限公司；
腈菌唑（纯度>97.5%），成都麦卡希化工有限公司；
烯唑醇（纯度>98.5%），麦克林试剂有限公司；
氟康唑（纯度>98%），北京庆凯华丰科技开发有限公司；
磁性氧化石墨烯（纯度>97%），中国科学院成都有机化学有限公司；
苯胺基甲基三乙氧基硅烷(KH-42，纯度>95%)、γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷(KH-792，纯度>95%)，成都麦卡希化工有限公司；
甲醇（色谱纯），百灵威科技有限公司；
无水乙醇、正硅酸乙酯、十六烷基甲基溴化铵、氨水、硝酸铵均为分析纯，国药试剂有限公司。
1.3 标准溶液配制
分别精确称取0.01g联苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇标准品， 用乙腈溶解，并定容到100mL容量瓶中，配制成浓度为100mg/L的标准储备液，保存于4℃冰箱中。在绘制标准曲线时，分别取储备液0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL，用乙腈溶解，并定容到100mL容量瓶中制成质量浓度为0.1~1 mg/L的标准溶液。
1.4 分子印迹聚合物的制备[9]
将0.5g磁性氧化石墨烯分散于300mL 60%的乙醇水溶液中，加入2g十六烷基甲基溴化铵，用氨水调节pH至9.5，超声1h。150r/min搅拌下逐渐滴入5mL正硅酸乙酯，室温下反应过夜。磁收集固体，并真空抽滤，用20mL无水乙醇洗涤后收集材料。于60℃下，真空旋转蒸发6h，得到介孔硅磁性氧化石墨烯材料（MGO@MS）。分别精确称取0.01mg联苯三唑醇、腈菌唑、烯唑醇混合后，加入50mL无水乙醇充分分散，滴加5mL去离子水并充分混合，分别缓慢滴加1.5mL的γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷（KH-792）和0.5mL的苯胺基甲基三乙氧基硅烷（KH-42），室温反应30min后，加入0.5g的MGO@MS，反应过夜，在磁场作用下分离反应物，先用100mL 20%甲酸甲醇溶液洗涤，然后用100mL甲醇洗至中性，真空干燥得到分子印迹聚合物（MGO@MS@MIP）。不添加模板分子的即为非印迹聚合物（MGO@MS@NIP）。
1.5 分子印迹聚合物固相萃取柱的制备
使用的固相萃取柱内径为 1cm，长为15cm，填充到固相萃取柱中的MIP，其腈菌唑、联苯三唑醇和烯唑醇的质量比为1：1：1，柱填装高度为 5cm，固相填装结束后在柱上端加少量脱脂棉并轻轻挤压使之充实。
1.6 样品前处理
1.6.1 提取
将100.0g番茄样品，切成丁状后置于粉碎机中，捣碎5min。将破碎后的番茄汁转入500mL烧杯中，在烧杯中加入100.0mL乙腈，密封，然后置于超声波清洗器中超声10min，取出后用离心杯分装，平衡，经8000r/min离心10min，取100.0mL上清液，过0.22μm有机滤膜，收集后待进行下一步的磁性固相萃取。
1.6.2 磁性固相萃取实验[10-12]
称取100.0mg MGO@MS@MIP于烧杯中，加入100.0mL提取的上清液，100r/min下振荡吸附30min，然后在施加外磁场作用下收集吸附完成的吸附剂，用100mL 20%甲酸甲醇溶液洗脱30min，最后吸取洗脱液过0.22μm有机滤膜过滤后，进行HPLC分析。
1.7 液相条件
色谱柱：InertSustain AQ-C18（250mm×4.6mm，5μm)；
流动相：甲醇-水（体积比为85：15）；
柱温：25℃；
流速：0.8mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：210nm。
1.8 试验设计
1.8.1 分子印迹聚合物固相萃取条件优化
采用分子印迹聚合物MGO@MS@MIP为吸附剂，吸附剂用量为100mg；
样品为配置的标准样品，腈菌唑、联苯三唑醇和烯唑醇浓度均为100mg/L，体积为100 mL；
萃取时间为0.5h，洗脱时间为0.5h，通过调整不同的进料溶液pH值（分别为4.0、 5.0、 6.0、 7.0、8.0），考察其对提取回收率的影响。在确定最优的溶液进料pH值后，考察不同样品进样体积（20、40、60、80、100 mL），确定最优进料体积后，萃取时间分别为5、10、20、40、60、80 min，最后，使用20%甲酸甲醇溶液进行洗脱，洗脱时间分别为10、20、30、40、50、60 min，收集并测定洗脱液中腈菌唑、联苯三唑醇和烯唑醇的含量，然后计算各组分的回收率。
1.8.2 检测方法（方法学确认）
（1）线性范围与检测限
配制浓度为0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0 mg/L标准溶液，HPLC分析后，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，通过线性回归得到标准曲线和方程式，通过方程式来评估方法的线性范围及其相关性。以信噪比S/N=3计算检出限。
（2）回收率与精密度
分别在0.05、0.50、1.00 mg/kg 3个水平下添加到实际样品中进行加标回收实验，来验证不同浓度下3种杀菌剂的回收率和精密度。
2.1 磁性分子印迹聚合物的表征
采用SEM分别对磁性材料MGO@MS和MGO@MS@MIP的表面和内部进行形态扫描，结果如图1所示，从外表可见，MGO@MS的结构相对规整、表面更加光滑，而MGO@MS@MIP粒径明显增大，个体相对饱满。从内部结构来看，修饰后的MGO@MS@MIP内部更为紧密，沟壑相对要少，说明分子印迹聚合物已经成功修饰至MGO@MS材料中。
图1 扫描电子显微镜下观察MGO@MS和MGO@MS@MIPFig. 1 Scanning electron microscope observation of MGO@MS and MGO@MS@MIP
采用FT-IR对材料中的官能团进行分析，从图2的红外光谱图可知，3条曲线均在490cm-1和l098cm-1处存在一致的吸收峰，而只在MIP和NIP曲线观察到3450cm-1处的吸收峰。490cm-1为载体中的含有的磁性Fe3O4颗粒所产生的Fe-O吸收峰。1098cm-1硅氧键有高强度拉伸振动作用引起的Si-O-Si吸收峰。3450cm-1吸收峰为功能单体的N-H弯曲振动所致。通过对MIP和NIP红外光谱图进行比较发现，它们具有高度相似的振动吸收峰，表明MIP和NIP的官能团和结构是一致的，进一步说明印迹材料已经不携带模板分子，印迹材料已完成制备。
图2 MGO@MS、MGO@MS@NIP和MGO@MS@MIP红外光谱图Fig. 2 Infrared spectra of MGO@MS, MGO@MS@NIP and MGO@MS@MIP
通过测试MGO@MS和MGO@MS@MIP的磁滞曲线，磁化强度可以反馈出分子印迹材料的分离效果，从图3结果可知，MGO@MS因未经修饰其磁化后，饱和磁化强度可达18.12emu/g。但是，当在其表面进行分子印迹聚合物修饰后，所得产物(MGO@MS@MIP)的饱和磁化强度发生明显的降低，降至4.32emu/g，尽管MGO@MS@MIP的磁化强度下降但仍表现出较好的超顺磁性，因此，该方法制备的分子印迹聚合物可用于三唑类的快速分离。
图3 MGO@MS和MGO@MS@MIP磁滞回线图Fig. 3 MGO@MS and MGO@MS@MIP hysteresis loops
2.2 分子印迹聚合物的吸附选择性
利用结构类似物氟康唑评价MGO@MS@MIP磁性材料对腈菌唑、联苯三唑醇和烯唑醇三种杀菌剂的特异性吸附能力，结果如图4所示。不管是MGO@MS@NIP还是MGO@MS@MIP对氟康唑都基本不吸附，MGO@MS@NIP对腈菌唑、联苯三唑醇和烯唑醇的吸附量分别为0.75、0.87、0.73 mg/g，而MGO@MS@MIP对三种杀菌剂的吸附量分别为8.92、4.86、6.87 mg/g。可见，MGO@MS@MIP和MGO@MS@NIP对三种杀菌剂的吸附量相差较大，说明MGO@MS@MIP对三唑类物质有良好的吸附选择性，且对三种不同三唑类杀菌剂吸附选择性不同。
图4 MGO@MS@NIP和MGO@MS@MIP对三唑类杀菌剂的吸附选择性Fig. 4 Different selective adsorption of MGO@MS@NIP and MGO@MS@MIP on triazole fungicides
2.3 分子印迹聚合物萃取条件优化
图5~图8显示了分子印迹聚合物MGO@MS@MIP对三唑类物质的不同萃取条件对洗脱收率的影响。
图5 样品pH值对洗脱回收率的影响Fig. 5 Influence of pH value on elution recovery
图8 洗脱时间对洗脱收率的影响Fig. 8 Effect of elution time on elution recovery
从图5可知，在pH值4~7范围内，三种三唑类杀菌剂的回收率随着上样溶液pH值的上升而上升，当上样溶液pH值 >7时，联苯三唑醇和腈菌唑的洗脱回收率均出现不同程度的降低，而烯唑醇的洗脱回收率继续缓慢上升。可能的原因为低pH值有利于吸附剂表面的氨基进行质子化作用，给电子能力减弱从而强化了氨基与目标物质的氢键作用力，不容易被酸溶液洗脱，造成整体的回收率低。当继续增大进料pH值时，由于体系中游离的铵根离子迅速增多，弱化了吸附剂上的氨基与目标物质的氢键作用，所以整体回收率上升。而氨基在不同的物质中去质子化不同，造成不同三唑类在最佳吸附量下为不同的pH值[13]。从图6可知，杀菌剂的回收率随着溶液体积的增加而降低，在相同进料质量下，样品体积小则吸附剂浓度高，高浓度的样品进料有利于吸附率的提高，从产品的检测灵敏度考虑，选取100mL为进料体积。从图7可以看出，在萃取5min初始阶段，GO@MS@MIP表面有大量的吸附位点，高浓度的目标物快速占据吸附位点，因此吸附量迅速增大。当萃取时间达到40min后吸附速率变缓，在50min基本吸附平衡。萃取吸附时间较佳为50min。从图8可知，三种唑类杀菌剂在MGO@MS@MIP上的洗脱率变化具有高度一致性，在2~20 min范围内，三唑类杀菌剂在MGO@MS@MIP上的洗脱率随着时间的增长而快速升高，达到78%以上，继续延长洗脱时间至80min，洗脱率则缓慢上升至90%左右，所以较佳的洗脱时间为20min。
图6 样品进料体积对洗脱回收率的影响Fig. 6 Influence of sample feed volume on elution recovery
图7 萃取时间对洗脱回收率的影响Fig. 7 Effect of extration time onelution recovery
2.4 方法学确认
2.4.1 线性范围与检测限
从表1可以看出，3种三唑类杀菌剂的质量浓度在0.3～200.0 mg/L时，所得到的线性回归方程的具有良好的相关性，决定系数R2>0.990，说明得到的回归线性方程可以使用。在该检测范围内，联苯三唑醇的检测限最小，达到了6.52×10-2mg•kg-1。
表1 3种三唑类杀菌剂线性范围和检测限Table 1 Linear range and detection limit of three triazole fungicides
2.4.2 回收率与精密度
从表2可知，3种杀菌剂检测的平均回收率在96.34%~101.82%，相对标准偏差(RSD)在1.76%~3.27%，均满足RSD<5%范围内的标准要求。当添加的质量浓度为0.05~0.50 mg/kg时，回收率为96.34%~99.23%，相对标准偏差≤2.67%；
当添加的质量浓度为0.50~1.00 mg/kg时，回收率为97.13%~101.82%，相对标准偏差≤3.27%。因此，该检测方法可以运用在不同浓度范围的检测且准确度高、重复性好。
表2 番茄中3种三唑类杀菌剂的添加回收率和相对标准偏差（n=3）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of three kinds of triazole fungicides in tomato (n=3)
2.5 讨论
分子印迹-高效液相色谱法应用于番茄中三唑类杀菌剂残留测定，克服了传统前处理手段的目标产物分离困难、基质干扰大、检测时间长、回收率低等一系列问题。采用MIP对目标物和结构类似物的吸附试验，表明MIP对该三唑类物质或其粒径结构类似物都具有良好的吸附效果，将其运用于样品的分离检测，得到了良好的结果，3种三唑类杀菌剂平均回收率在96.34%~101.82%，相对标准偏差（RSD)在1.76%~3.27%。另外，三唑类杀菌剂使用分子印迹固相萃取-高效液相色谱分析为不同种类模板同时提供理论依据其改变了传统分子印迹技术只针对一种或一类物质有高回收率特异性吸附能力的现状。
本文以分子印迹和色谱技术相结合，开发了应用于番茄可同时测定腈菌唑、联苯三唑醇和烯唑醇等杀菌剂的方法，该方法灵敏度高、重现性好、分析速度快，是一种比较有前景的分析方法。分子印迹固相萃取技术除了可以用于农兽药等有毒物质的残留检测外，还可以用于食品添加剂等违规物质的检测。但是分子印迹技术也存在一些问题，例如目标物质的选择及制备材料来源受限、应用对象和应用领域相对狭窄、聚合物材料还无法很好地在水相中合成等一系列问题。随着新材料的不断发现和检测仪器的不断更新发展，这种分子印迹制备技术将会更加完善，其应用将会更加广阔。
猜你喜欢三唑联苯印迹国家药监局关于联苯乙酸凝胶处方药转换为非处方药的公告（2021年第148号）中老年保健(2022年3期)2022-08-24马 浩陶瓷研究(2022年3期)2022-08-19走进大美滇西·探寻红色印迹云南画报(2021年10期)2021-11-24多溴联苯醚在环境中迁移转化的研究进展化工设计通讯(2021年4期)2021-01-07抗菌多肽改性杂萘联苯聚芳醚腈酮研究中国材料进展(2019年10期)2019-12-07成长印迹小学生优秀作文(高年级)(2018年4期)2018-09-11不同浓度三唑锡悬浮剂防治效果研究中国果菜(2016年9期)2016-03-01三组分反应高效合成1,2,4-三唑烷类化合物西华师范大学学报（自然科学版）(2015年3期)2015-02-27印迹中国摄影(2014年12期)2015-01-271,1′-二(硝氧甲基)-3,3′-二硝基-5,5′-联-1,2,4-三唑的合成及性能火炸药学报(2014年5期)2014-03-20