刘 靖 代 鹏 罗浏晗 黄 宇
肠易激综合征（IBS）是一种肠道功能障碍综合征，表现为腹部不适或腹痛并伴有排便异常，严重影响患者的生活质量[1-2]。探究IBS的发病机制并寻求有效的生物学标志物以评估患者症状和病情严重程度是近年来的研究热点。研究表明，精神心理因素、胃肠运动紊乱、脑-肠轴失调、肠道菌群紊乱等多种因素可导致IBS发生，其中脑-肠轴失调使肠道发生氧化应激已成为IBS发病机制研究的一个切入点[3-4]。过氧化物酶1（PRDX1）是氧化应激的关键调控蛋白[5]。黄韵洁等[6]的研究发现，PRDX1可通过控制活性氧（ROS）的水平负向调控氧化应激引起的细胞凋亡。法尼酯衍生物X受体（FXR）是一种在肝肠系统等组织器官中表达的胆汁酸受体，属于激素核受体超家族一员[7]。杨保伟等[8]的研究发现，FXR在腹泻型IBS患者的肠黏膜组织中呈异常表达。本研究通过检测PRDX1和FXR在IBS患者肠黏膜组织中的表达水平，以期明确两者在IBS发生和发展中的作用。
1.1 研究对象
选择2017年7月至2019年7月蒲江县人民医院收治的72例IBS患者作为研究对象（设为IBS组），另选择同期因痔疮出血或肠息肉等行内镜下切除手术的80例复查者（经肠镜及病理检查结果证实痔疮出血或肠息肉疾病均痊愈）设为对照组。纳入标准：（1）根据功能性胃肠病罗马Ⅲ诊断标准确诊IBS[9]；
（2）病理资料完整；
（3）至少 12 周（非连续性）有腹部不适或疼痛，排便后症状缓解；
（4）至少12周（非连续性）排便频率异常（即＞3次/d或＜3次/周）。排除标准：（1）糖尿病、甲状腺功能亢进或减退者；
（2）伴有肠道器质性病变者；
（3）心、肝、肾等脏器功能不全者。IBS组中男性43例，女性29例；
年龄23～77岁，平均年龄为（53.29±10.67）岁。对照组中男性40例，女性40例，年龄23～76岁，平均年龄为（53.29±10.51）岁。2组在性别、年龄方面的差异无统计学意义（χ2＝1.079，P＞0.05；
t＝0.844，P＞0.05）。所有研究对象及家属均签署知情同意书。本研究经医院医学伦理委员会批准（批件号20170513）。
1.2 主要试剂和仪器
鼠抗人PRDX1多克隆抗体（货号ND4672-8）和鼠抗人FXR多克隆抗体（货号M9382-9）购自北京中衫金桥生物技术有限公司，内源性过氧化物酶阻断剂（货号627925）、正常山羊血清（货号M78320J）、羊抗鼠二抗（货号O6721D）和DAB显色试剂盒（货号67869NJ）购自福州迈新生物技术有限公司。TRIzol试剂（货号MN562J2）、反转录试剂盒（货号J6547M）、荧光定量PCR试剂盒（货号N5643MJ）、SYBR Premix Ex Taq试剂盒（货号N5643MJ）、PrimeScript RT reagent试剂盒（货号ND6527J）、实时荧光定量PCR分析仪（型号7500）和分光光度计 （型号UV-3672） 购自美国Sigma公司。
1.3 临床资料收集
收集患者的性别、年龄、病程、消化道症状评分等一般资料，其中消化道症状评分＝排便困难得分＋腹痛/腹胀得分。排便困难分为排便费力、肛门阻塞感、排便不尽感和排便急迫感这4项，每项计分均按照如下标准：无记0分，轻度（偶有发生）记1分，中度（经常发生）记2分，重度（每次发生）记3分。排便困难得分为4项分值之和。腹痛/腹胀得分根据频率和程度计分。腹痛/腹胀频率计分标准：无记0分，＜1 d/月记0.5分，1 d/月记1分，3 d/月记1.5分，1 d/周记2分，＞1 d/周记2.5分。腹痛程度计分标准：轻度（腹痛轻微，不影响日常活动）记1分，中度（腹痛较轻，但不可忽视，日常活动尚不需调整）记2分，重度（腹痛较重，日常活动受影响且需要调整）记3分。腹胀程度计分标准：轻度（偶有腹胀，30 min 左右得到缓解）记1分，中度（经常腹胀，1～2 h不能缓解）记2分，重度（腹胀持续，超过2 h不能缓解，需服药后才能缓解）记3分。腹痛得分＝腹痛频率得分＋腹痛程度得分，腹胀得分＝腹胀频率得分＋腹胀程度得分，腹痛/腹胀得分＝腹痛得分＋腹胀得分。依据患者发病以来的整体感受，由医生与患者共同讨论完成评定。
1.4 标本采集
IBS组于入院时、对照组于复查时行结肠镜检查，均在退镜时，于距肛门口约20 cm的直肠与乙状结肠交界处钳取5块肠黏膜组织。其中2块采用中性甲醛固定24 h后，经80%、90%、95%的乙醇及无水乙醇进行脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片（厚度约5 μm），供免疫组织化学研究；
其余3块立即冻存于液氮中，供后续实时荧光定量PCR研究。
1.5 肠黏膜组织中PRDX1 mRNA和FXR mRNA的表达水平检测
采用实时荧光定量PCR法检测肠黏膜组织中PRDX1 mRNA和FXRmRNA的表达水平。使用TRIzol试剂提取所有入组者肠黏膜组织中的总RNA，按照试剂盒说明书进行操作，使用分光光度计测定RNA的浓度和纯度，以1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。以RNA为模板，按照PrimeScript RT reagent试剂盒说明书进行反转录反应得到cDNA，之后使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行实时荧光定量PCR反应。反应体系20 μL：2×UltraSYBR Mixture 10.0 μL，25 ng/μL 的 cDNA 2.0 μL，10 μmol/L 的正、反向引物各 2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。反应条件为：95 ℃预变性30 s；
95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共计40个循环。引物由大连宝生生物工程有限公司设计并合成，PRDX1和FXR均以GADPH作为内参。采用2-ΔΔCt法分析肠黏膜组织中PRDX1 mRNA和FXRmRNA的相对表达量。引物序列见表1。
表1 引物序列
1.6 肠黏膜组织中PRDX1和FXR蛋白水平检测
采用免疫组织化学染色法检测肠黏膜组织中PRDX1和FXR蛋白的表达水平。取1.4中的切片，使用二甲苯常规脱蜡水化，枸橼酸盐酸缓冲液微波加热后进行抗原修复，室温下行内源性过氧化物酶灭活，PBS洗3次，滴加正常山羊血清封闭15 min，倾去，勿洗；
加入鼠抗人PRDX1多克隆抗体（1∶100）及鼠抗人FXR多克隆抗体（1∶100）作为一抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗3次；
滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（1∶100）室温孵育10 min，PBS洗3次，DAB显色5～10 min，苏木素复染3 min，1%乙醇盐酸溶液分化3 s，碳酸锂返蓝5 s，脱水、透明、中性树胶封片。PBS代替一抗作为阴性对照。
结果判定：光镜下观察切片，每张切片随机选取5个不同高倍镜视野（×200）进行结果判定。PRDX1阳性判定标准：呈现淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒，主要位于细胞浆。FXR阳性判定标准：呈现棕黄色或棕褐色颗粒，主要位于细胞膜。按照阳性细胞数计数，5个视野取平均值，阳性细胞数＜10%判定为阴性，≥10%判定为阳性。
1.7 统计学方法
应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson相关系数法分析IBS患者肠黏膜组织中PRDX1 mRNA和FXRmRNA的表达水平与消化道症状评分的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 2组肠黏膜组织中PRDX1 mRNA和FXR mRNA的相对表达量比较
IBS组肠黏膜组织中PRDX1 mRNA的相对表达量为1.03±0.37，FXRmRNA的相对表达量为0.08±0.03，均低于对照组（1.96±0.69、0.66±0.21），2组间差异均有统计学意义（t＝10.192，P＜0.05 ；
t＝23.216，P＜0.05）。
2.2 2组肠黏膜组织中PRDX1和FXR蛋白阳性率比较
IBS组肠黏膜组织中PRDX1蛋白阳性率为20.83%，FXR蛋白阳性率为22.22%，均低于对照组（82.50%、85.00%），2组间差异均有统计学意义（χ2＝55.442，P＝0.000 ；
χ2＝57.895，P＝0.000）。
见表2。
表2 2组肠黏膜组织中PRDX1和FXR蛋白阳性率比较
2.3 IBS组患者肠黏膜组织中PRDX1 mRNA和FXR mRNA的表达水平与消化道症状评分的相关性
IBS组患者的消化道症状评分为（8.05±2.03）分。Pearson相关性分析结果显示，肠黏膜组织中PRDX1 mRNA的表达水平与消化道症状评分呈负相关（r＝-0.390，P＝0.000），FXRmRNA的表达水平也与消化道症状评分呈负相关（r＝-0.331，P＝0.000）。见图1、图2。
图1 肠黏膜组织中PRDX1 mRNA的表达水平与消化道症状评分的相关性
图2 肠黏膜组织中FXR mRNA的表达水平与消化道症状评分的相关性
IBS是一种功能性胃肠病，无器质性病变，临床主要表现为腹部不适或腹痛、排便异常。在欧美国家，IBS的患病率为10%～20%；
在中国，IBS的患病率为5.8%～7.5%[10]，严重影响患者的生活质量，并且给患者带来较大的精神负担。IBS的发病机制复杂，发病率较高，诊断存在一定困难。因此，探究IBS的相关机制并寻找有效的生物标志物具有重要意义。
有学者从脑-肠轴互动及氧化应激的角度探究IBS的发病机制，已证实氧化应激与IBS的发病进程有关[11]。氧化应激是指机体在遭受外界负面刺激时，氧化剂与抗氧化剂之间的平衡被破坏，从而促进细胞内活性氧分子大量产生和累积，最终导致机体发生氧化应激，造成组织损伤[12-13]。PRDX1是特异性巯基抗氧化蛋白超家族成员之一，主要分布于细胞质和细胞核中，其蛋白N端和C端分别含有1个高度保守的半胱氨酸残基（2-Cys），是氧化应激的调节器[14]。研究发现，下调PRDX1表达可导致HepG2细胞出现氧化应激损伤，降低HepG2细胞的存活率[15]。由此推测，PRDX1异常表达可能通过氧化应激参与IBS的发生和发展过程。本研究结果显示，IBS组肠黏膜组织中PRDX1 mRNA的相对表达量及PRDX1蛋白阳性率均显著低于对照组，这提示PRDX1表达与IBS的发生、发展有关，与上述研究结论相符。FXR是一种胆汁酸受体，参与肝肠循环，通过调控参与代谢的关键酶的转录水平，在体内发挥着重要的代谢调节作用，胆汁酸介导FXR的激活成为能量稳态维持、糖与脂肪代谢等过程的主要途径[16-17]。刘立萍等[18]的研究表明，苓桂树甘汤可能通过上调FXR表达调节肠道菌群，从而发挥对瘦素缺陷代谢紊乱模型小鼠骨损伤的保护作用。Torres等[19]的研究显示，FXR介导的机制可防止胆汁酸累积，保护肠道上皮屏障的完整性，防止肠道炎性反应发生。本研究结果显示，IBS组肠黏膜组织中FXRmRNA的相对表达量及FXR蛋白阳性率均显著低于对照组，这提示FXR表达可能与IBS的发生、发展关系密切。IBS患者的症状严重程度常以消化道症状评分表示，分值越高提示症状越严重[20]。本研究结果发现，IBS患者肠黏膜组织中PRDX1 mRNA和FXRmRNA的表达水平均与消化道症状评分呈负相关，这提示PRDX1 mRNA和FXRmRNA的表达水平均与IBS病情严重程度有关，进一步说明PRDX1和FXR可能参与了IBS的发生和发展过程。
综上所述，PRDX1和FXR在IBS患者肠黏膜组织中的表达水平较低，且均与患者消化道症状评分呈负相关，可能共同参与了IBS的发生和发展过程。本研究存在一定不足，如样本量较少，并且对照组为因痔疮出血或肠息肉等人群，缺少“无器质性”疾病人群数据，后期将扩大样本量进一步验证本文结论。
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