于洋，宋永才，杨立峰
汉中三二〇一医院骨科创伤关节外科，陕西 汉中 723000
关节软骨因其乏血管与乏细胞特性而难以修复与再生，软骨损伤可诱发关节疼痛、骨关节炎与功能障碍，临床主要采取保守治疗与手术治疗[1,2]，这些方法均存在一定的局限性。组织工程仿生支架技术为软骨难以修复和再生这一临床难题提供了解决办法。目前用于软骨组织工程仿生支架的材料主要有丝素蛋白[3,4]、胶原[5]、明胶[6]、壳聚糖[7,8]与透明质酸等，在体内外实验中均取得良好的效果。应用单一材料制备软骨组织工程仿生支架存在机械性能不足、体内稳定性差等缺陷，将两种或两种以上的材料合成复合支架，可以发挥优势互补的作用。但即使是复合材料制备的仿生支架也不能完全解决软骨损伤的问题，因此，仿生支架荷载药物成为研究的热点。聚糖具有与天然软骨中糖胺聚糖相似的生物活性，对于生长因子的结合与载荷具有一定的优势，同时具有抗菌性能。丝素蛋白为一种天然高分子材料，具有无毒、可降解、生物相容性及良好机械性能等特性。骨碎补总黄酮为中药骨碎补的有效成分之一，具有补益肝肾、活血止痛和强筋壮骨等功效，临床已用于治疗骨质疏松性骨折、骨不连、股骨头坏死等[9,10]。体外实验显示，骨碎补总黄酮可促进间充质干细胞与成骨细胞的增殖及分化[11,12]，促进骨性关节炎家兔间充质干细胞增殖并向软骨向分化[13]。动物实验显示，骨碎补总黄酮可增加去卵巢大鼠股骨密度和机械强度，改善骨小梁微结构[14]；
可减轻膝骨性关节炎模型兔滑膜及软骨的损伤程度[15]。但是将骨碎补总黄酮局部应用于软骨损伤的研究报道不多见，本实验以丝素蛋白/壳聚糖支架为载体将骨碎补总黄酮应用于兔软骨损伤局部，观察软骨损伤修复效果，期为临床实际应用提供实验数据。
1.1 动物来源及主要试剂
6 月龄健康雄性新西兰大白兔24 只，体重（2.8±0.2）kg，动物合格证号SCXK(陕)2017-003，购自西安交通大学医学院实验动物中心；
壳聚糖（山东卫康生物医药科技有限公司）；
骨碎补总黄酮（北京岐黄制药有限公司，国药准字Z20133051）；
鼠抗兔II 型胶原蛋白抗体（鼠抗兔II 型胶原蛋白抗体）；
M-MLV 试剂盒（上海晶抗生物工程有限公司）；
高效液相色谱仪（LC600C，南京科捷分析仪器有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 制备丝素蛋白/壳聚糖支架[16]将剪碎后的家蚕丝与0.5% Na2CO3溶液按1：20 比例混合，置于100 ℃沸水中煮沸30 min 脱胶，用去离子水清洗3 次，60 ℃鼓风干燥箱内烘干备用。将脱胶后的蚕丝放入9.3 mol/L LiBr 溶液，置于60 ℃恒温水浴锅中持续搅拌，使蚕丝完全溶解，获得丝素蛋白溶液。将丝素蛋白溶液放入截留分子量为12 000 的透析袋中，去离子水透析3 d，去除杂质。将透析后的丝素蛋白溶液过滤后稀释至浓度20 g/L，4 ℃保存备用。将2 g 壳聚糖在室温溶解于100 mL 醋酸溶液（0.1 mol/L），磁力搅拌4 h，使壳聚糖完全溶解，获得浓度为20 g/L 的壳聚糖溶液，4 ℃保存备用。将20 g/L 的丝素蛋白溶液与20 g/L 的壳聚糖溶液按50：50 比例混合，室温下磁力搅拌机上持续搅拌，随后将混合溶液装入模具中，置于-20 ℃保存12 h，再放入冻干机中低温干燥36 h，获得丝素蛋白/壳聚糖支架。应用前将支架经紫外线照射24 h，再放入75%酒精中浸泡30 min，用无菌PBS清洗3 次，最后置入培养基中，4 ℃保存备用。扫描电子显微镜下观察支架的微观形貌。
1.2.2 制备缓释微球[17,18]将5 mg 骨碎补总黄酮加入5 mL 去离子水中（内水相），将250 mg 聚乳酸羟基乙酸共聚物（50：50，深圳聚合生化科技有限公司）加入10 mL 二氯甲烷与丙酮溶剂中（油相）；
将内水相逐滴加入油相中，内水相与油相体积比为1：4；
超声波100 W 超声30 s，形成初乳；
将初乳逐滴加入50 mL 1%聚乙烯醇溶液（外水相）中，超声波100 W 超声30 s，形成复乳；
转至通风橱内500 r/min 磁力搅拌过夜，15 000 r/min 离心10 min，弃上清液，用PBS 清洗2 次，即得到骨碎补总黄酮/聚乳酸羟基乙酸共聚物微球混悬液，放入冷冻干燥机干燥，即可得到骨碎补总黄酮缓释微球。扫描电子显微镜下观察微球形貌。
1.2.3 制备负载骨碎补总黄酮支架 将丝素蛋白/壳聚糖支架放入平底离心管中，加入骨碎补总黄酮/聚乳酸羟基乙酸共聚物微球混悬液，混合均匀后4 000 r/min 离心15 min。弃上清，加入5 mL 10%明胶溶液，2 000 r/min 离心10 min，置于真空干燥机中冷冻24 h，获得负载负载骨碎补总黄酮的丝素蛋白/壳聚糖支架，4 ℃保存备用。扫描电子显微镜下观察支架的微观形貌。
1.2.4 检测负载骨碎补总黄酮支架的缓释性能 将一定质量的负载骨碎补总黄酮的丝素蛋白/壳聚糖支架浸泡于10 mL PBS 中，37 ℃环境下120 r/min 持续震荡，于设定的时间点离心取上清液，同时将支架取出后冻干，检测质量变化，随后补充等量的新鲜PBS。利用高效液相色谱仪（LC600C，南京科捷分析仪器有限公司）检测上清液内骨碎补总黄酮的浓度，绘制骨碎补总黄酮累积释放曲线。
1.2.5 动物造模及分组 取健康雄性新西兰大白兔24 只，随机数字表法分为3 组，每组8 只，每只兔的双下肢建立膝关节软骨损伤模型，具体方法为：耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠30 mL/kg 麻醉实验兔，术区备皮、消毒、铺无菌洞巾；
沿髌骨内侧作2 cm 纵形切口，切开内侧关节囊和部分股内侧肌，显露关节腔，将髌骨向外侧脱位，充分显露股骨滑车，利用电钻在股骨滑车上制备直径3.5 mm、深1.5 mm 的软骨损伤模型（图1），随后对照组植入丝素蛋白/壳聚糖支架，实验组植入负载骨碎补总黄酮的丝素蛋白/壳聚糖支架，空白组不做处理，反复活动膝关节确保支架牢固后复位髌骨，逐层缝合。动物清醒后自由活动，不进行制动处理，术后连续3 d 肌肉注射青霉素40 万U/d 预防感染。每天观察实验兔活动与伤口愈合情况。
图1 关节软骨缺损造模与支架植入Fig.1 Modeling and stent implantation of articular cartilage defect
1.2.6 大体观察 术后12 周、24 周时，过量麻醉处死实验兔，取双侧膝关节股骨髁，肉眼观察关节软骨缺损处植入材料的情况及修复软骨的大小范围、颜色、光滑度等，同时拍照记录。按照国际软骨修复协会（International Cartilage Repair Society，ICRS）[19]形态评分，包含缺损修复程度、边界整合情况、外观大体观察3 个项目，每项包括5 个小条目，对应得分0～4 分，将各项目评分相加，完全正常为12 分（I级），修复良好为8～11 分（Ⅱ级），有修复但效果不佳为4～7 分（Ⅲ级），无修复效果为0～3 分（Ⅳ级），得分越高修复效果越明显。
1.2.7 组织学观察 截取关节软骨损伤部位，剔除肌肉等软组织，将关节软骨标本置于10%甲醛中固定7 d，脱钙液脱钙6 周至骨质变软，梯度酒精脱水，石蜡包埋标本，切片，分别进行HE 染色、番红O 染色与甲苯胺蓝染色。番红O 染色步骤：切片放入Weigert 染液浸染5 min；
酸性分化液分化15 s；
放入固绿染色液浸染5 min，蒸馏水清洗1 min；
放入Safranin O stain 染液浸染2 min，蒸馏水洗1 min；
用弱酸溶液清洗切片1 min，蒸馏水清洗1 min；
分别经95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，光学树脂封固，光学显微镜下观察。甲苯胺蓝染色步骤：切片放入65 ℃恒温烤箱烘烤30 min，二甲苯I 15 min，二甲苯Ⅱ15 min，梯度乙醇水合，自来水冲洗2 min，甲苯胺蓝染色液浸染30 min，自来水冲洗，滤纸吸干水分，切片上滴入丙酮分化至软骨层呈紫蓝色，逐级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶和盖玻片封固，光学显微镜下观察。依据改良的Wakitani 组织学评分标准[20]，主要从细胞种类、染色情况、表面完整性、软骨厚度及移植组织与受体周围组织的完整性5 个方面进行评估，得分0～14 分，评分越低修复效果越好。
1.2.8 RT-PCR 检测软骨缺损部位Sox-9、II 型胶原与聚集蛋白聚糖mRNA 表达量 提取软骨组织总RNA，根据M-MLV 试剂盒说明书操作进行反转录操作，利用Primer Express 2.0 和Beacon designer 软件设计引物序列（表1），以18SrRNA 作为内参。RT-PCR反应条件为：95℃预变性10 s；
95℃变性5 s；
62℃退火/延伸25 s（收集荧光信号）；
45 个循环。每个样品重复3 次。
1.2.9 Western blot 检测软骨缺损部位Ⅱ型胶原蛋白表达 取一定的软骨组织，加入组织裂解液裂解30 min，1200 r/min 离心15 min，取上清液。95 ℃煮沸10 min 变性，-20 ℃保存。采用BCA 法检测蛋白浓度。取20 μL 蛋白样品，加入5 μL 的6×蛋白上样缓冲液混匀，加热5 min 后冷却；
按预定的顺序上样、恒压电泳，将目的蛋白转移至PVDF 膜上，脱脂牛奶封闭1 h，加入稀释的鼠抗兔Ⅱ型胶原蛋白抗体（稀释度为1：500），4 ℃孵育过夜；
加入羊抗小鼠二抗（稀释度为1：2000），室温孵育1 h，以GAPDH为内参；
ECL显影、曝光。
1.3 统计分析
所有实验数据以平均值±标准差表示，使用SPSS22.0 软件进行统计分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。
2.1 支架与微球的微观形貌
扫描电子显微镜下可以观察到，丝素蛋白/壳聚糖支架具有良好的三维孔隙结构，孔洞之间相互联通，其孔径约为60～110 μm；
制备的载药微球表面较光滑，为较规则的圆球形；
载药微球均匀分散于丝素蛋白/壳聚糖支架基质中，见图2。
图2 丝素蛋白/壳聚糖支架微观形貌A：丝素蛋白/壳聚糖支架B：骨碎补总黄酮缓释微球C：负载骨碎补总黄酮的丝素蛋白/壳聚糖支架Fig.2 Microstructure of silk fibroin/ chitosan scaffoldA: silk fibroin/ chitosan scaffold; B: Rhizoma Drynariae total flavonoids sustained release microspheres; C: Silk fibroin/ chitosan scaffold loaded with total flavonoids of Rhizoma Drynariae
2.2 负载骨碎补总黄酮支架的缓释性能
由图3 药物释放曲线可见，在最初的6 d 内缓释微球出现突释现象，此后释放逐渐减慢，至16 d 骨碎补总黄酮释放量达到总量的49%，此后缓慢而平稳地释放骨碎补总黄酮，至32 d 骨碎补总黄酮释放量达到约58%。
图3 负载骨碎补总黄酮支架的体外缓释性能Fig.3 In vitro sustained release performance of total flavonoids scaffold loaded with osteofragmentum
2.3 关节软骨修复大体观
动物术后关节软骨修复大体观见图4。术后12周，空白组软骨损伤区域仅见少量组织填充，软骨缺损边界清晰可见；
对照组软骨损伤区域被少部分组织填充，可清晰分辨软骨缺损边界；
实验组软骨损伤表面较光滑，损伤区域被大量修复组织填充，可见缺损边界。术后24 周时，空白组软骨损伤区域修复组织有少量增加，修复表面粗糙，软骨缺损边界依然清晰可见；
对照组软骨损伤区域与周围正常软骨界面进一步整合，修复区域可见不完全的软骨组织裂隙；
实验组软骨损伤区域几乎修复完全，修复表面光滑平整，缺损边界模糊不清，外观接近正常软骨组织，修复区域较连续平整。
图4 兔关节软骨大体观 A、D：空白组B、E：对照组C、F：实验组Fig.4 General view of articular cartilage in three groups A,D :Blank group;B,E:Control groups; C,F:Experimental group
ICRS 评分结果显示（表2），对照组、实验组术后12 周、24 周评分均高于空白组，差异有统计学意义，实验组术后12 周、24 周评分均高于对照组，差异有统计学意义。
表2 兔关节软骨大体ICRS 评分与Wakitani 组织学评分（）Tab.2 The gross ICRs score and Wakitani histological score of articular cartilage in three groups (Mean±SD)
表2 兔关节软骨大体ICRS 评分与Wakitani 组织学评分（）Tab.2 The gross ICRs score and Wakitani histological score of articular cartilage in three groups (Mean±SD)
注：①P＜0.05，与空白组对比 ②P＜0.05，与对照组对比Note: ①P＜0.05,compared with the blank group;②P＜0.05,compared with the control group
2.4 关节软骨修复组织学观察
各组术后关节软骨的组织学观察见图5～7。
图5 兔关节软骨组织学观察（HE 染色，箭头指示缺损区） A、D：空白组B、E：对照组C、F：实验组Fig.5 Histological observation of articular cartilage in three groups (HE staining,the arrow indicated the defect area) A，D: Blank group; B，E : Control group; C，F: Experimental group
图6 兔关节软骨组织学观察（番红O 染色，箭头指示缺损区） A、D：空白组B、E：对照组C、F：实验组Fig.6 Histological observation of articular cartilage in three groups (safranin O staining,the arrow indicated the defect area)A，D: Blank group; B，E: Control group; C，F: Experimental group
图7 兔关节软骨组织学观察（甲苯胺蓝染色，箭头指示缺损区） A、D：空白组B、E：对照组C、F：实验组Fig.7 Histological observation of articular cartilage in three groups (toluidine blue staining,the arrow indicated the defect area) A，D: Blank group；
B，E: Control group；
C，F: Experimental group
HE 染色显示，术后12 周，空白组软骨缺损区域无明显修复，仅在缺损周围可见少量纤维组织；
对照组可见较多的新生组织填充于软骨缺损区域，修复表面较光滑且连续，可分辨缺损区域与周围正常组织分界，修复效果较明显；
实验组可见大量的新生组织填充于软骨缺损区域，修复表面光滑且较平整，与周围正常组织界限模糊，修复效果较对照组更加明显。术后24 周，空白组软骨缺损区域被大量的纤维组织填充，与周围正常组织有部分连接；
对照组可见新生组织填充于软骨缺损区域，修复表面光滑且平整，与周围正常组织界限模糊；
实验组可见新生组织几乎填满了软骨缺损区域，修复表面光滑且平整，与周围正常组织无明显分界。
番红O 染色与甲苯胺蓝染色显示，术后12 周，空白组软骨缺损区域无明显的番红O 着色与甲苯胺蓝着色，对照组软骨缺损区域可见淡染的番红O 着色与甲苯胺蓝着色，实验组可见深染的番红O 着色与甲苯胺蓝着色；
术后24 周，空白组仍未见明显的番红O 着色与甲苯胺蓝着色，对照组可见深染的番红O 着色与甲苯胺蓝着色，实验组可见更深的番红O 着色与甲苯胺蓝着色。
Wakitani 组织学评分结果显示，对照组、实验组术后12 周、24 周的评分均低于空白组，差异有统计学意义，实验组术后12 周、24 周的评分均低于对照组，差异有统计学意义。3 组术后Wakitani 组织学评分情况见表2。
2.5 RT-PCR 检测
RT-PCR 检测各组新生组织内Sox-9、II 型胶原与聚集蛋白聚糖mRNA 表达量，结果显示，实验组Sox-9、II 型胶原与聚集蛋白聚糖mRNA 表达量最高，空白组Sox-9、II 型胶原与聚集蛋白聚糖mRNA 表达量最低，组间差异有统计学意义，见图8。
图8 兔关节软骨组织软骨相关基因检测Fig.8 Detection of cartilage related genes in articular cartilage of rabbits in three groups
2.6 Western blot 检测
实验组术后12 周、24 周的Ⅱ型胶原蛋白表达量最高，空白组术后12 周、24 周的Ⅱ型胶原蛋白表达量最低，组间差异有统计学意义，见图9。
图9 兔关节软骨组织II 型胶原蛋白检测Fig.9 Detection of type II collagen in articular cartilage of rabbits in three groups
关节软骨损伤几乎是所有关节疾病如创伤性关节炎、类风湿性关节炎、股骨头坏死等病理变化的早期阶段，所以，修复软骨损伤是治疗此类疾病的关键所在[21]。由于软骨组织内缺乏血管、淋巴分布与软骨细胞，缺少细胞分化所必需的祖母细胞，而包埋于稠厚细胞外基质中的祖母细胞迁徙难度大，无法移动到损伤部位参与修复，导致其损伤后自我修复较差，目前临床开展的微骨折术、自体软骨与同种异体软骨移植术等的治疗效果仍有一定局限性[22,23]。组织工程为临床软骨修复问题提供了良好的策略。
骨碎补总黄酮可促进骨髓间充质干细胞的增殖与成软骨分化，并可通过SDF1/CXCR4 信号途径促进骨髓间充质干细胞的迁移[24]。本实验将单纯的丝素蛋白/壳聚糖支架与负载骨碎补总黄酮缓释微球的丝素蛋白/壳聚糖支架分别植入兔关节软骨缺损部位，术后12 周、24 周处死实验动物，观察膝关节软骨缺损部位修复效果。实验中造模实验兔至取材前均存活，兔的生长状态良好，未发生死亡现象，亦未发生关节腔与伤口感染现象，提示实验所植入的支架材料具有较好的生物相容性。关节软骨损伤部位大体观察显示，空白组软骨缺损部位几乎无明显的修复效果，至术后24 周仅显示纤维组织修复，提示软骨损伤自我修复能力不明显；
植入单纯的丝素蛋白/壳聚糖支架后软骨缺损部位可见明显的修复效果，提示该支架可为种子细胞提供良好的微环境，适合作为软骨组织工程支架，与以往的研究结果一致[25]。Bhardwaj 等[11]研究证实，丝素蛋白/壳聚糖支架支持细胞的附着与增殖，可诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞，可作为软骨组织工程支架。而负载骨碎补总黄酮缓释微球的丝素蛋白/壳聚糖支架植入后的软骨缺损修复效果明显优于对照组，至术后24 周的修复外观接近正常软骨组织，说明骨碎补总黄酮在其中发挥了重要作用。
为进一步证实大体观察结果进行组织学检测，结果显示，空白组至术后24 周为纤维组织修复，对照组术后12 周、24 周的软骨修复效果显著优于空白组，HE 染色、番红O 染色与甲苯胺蓝染色证实缺损部位形成了新的软骨组织，修复效果明显；
而实验组术后12 周、24 周的软骨修复效果显著优于对照组，HE 染色、番红O 染色与甲苯胺蓝染色证实软骨缺损部位形成了更加成熟与更多的软骨组织，修复效果更加显著。体外缓释实验显示，负载骨碎补总黄酮的丝素蛋白/壳聚糖支架可持续稳定地释放药物，当负载药物的支架植入软骨缺损部位后，不断释放的骨碎补总黄酮促进自体干细胞迁移至软骨损伤部位，使其增殖并分化为软骨细胞，参与软骨损伤的修复。RT-PCR 检测同样证实，骨碎补总黄酮可提高软骨修复区域软骨相关基因的表达。
致密的细胞外基质是关节软骨的重要组成部分，主要包括Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖，而Ⅱ型胶原蛋白表达上调是软骨形成的重要特征之一，可以反映软骨的再生[26]。体外实验证实，骨碎补总黄酮可促进间充质干细胞的增殖并分化为软骨细胞，提高细胞分泌细胞外基质的能力。Western blot 检测结果显示，实验组再生组织中的Ⅱ型胶原蛋白表达始终高于对照组，证实骨碎补总黄酮可提高细胞分泌细胞外基质的能力。
综合以上结果，负载骨碎补总黄酮的丝素蛋白/壳聚糖支架植入软骨损伤部位后可持续缓慢地释放骨碎补总黄酮，为种子细胞的生长与分化提供适合的微环境，有效促进软骨组织再生，其相关机制有待深入研究。
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