李建正，张 丽，刘应鹏，朱丽萍，魏志刚,周延州
(1.河南后羿实业集团有限公司，河南 郑州 450000；
2.河南牧业经济学院，河南 郑州 450046)
虫草菌种是从天然冬虫夏草子实体中分离而得的蝙蝠蛾拟青霉菌、再由人工液体发酵培养和固体培养制成虫草菌丝体，其有效成分主要是虫草多糖和甘露醇类似物。虫草多糖是虫草菌丝体含量较高的生物活性物质之一，能够显著增强肝脏超氧化物歧化酶活性，有明显的抗氧化、清除氧自由基和羟自由基的作用，具有提高机体免疫能力，抗病毒作用，具有改善呼吸系统，止咳、化痰、润肺和延缓衰老等药理作用[1，2]。
杜仲叶中黄酮类物质的含量较高，有较强的抗菌、抗病毒和抗氧化作用，其中苯丙素类化合物中绿原酸、香草酸活性成分的含量较高，抗菌、抗病毒作用较强[3]。杨树花含有皂苷、鞣酸、黄酮类多酚物质，具有清热解毒、化湿止痢等药理作用，对细菌性痢疾、肠炎疗效较好，还可有效缓解畜禽发病期间的各种炎症和应激反应[4]。
中药提取物及发酵中药是融合现代制药新技术的新型产品，具有广阔的市场空间，有良好的产业化发展前景。近年来，发酵中药已成为研究热点。研究表明蛹虫草菌代谢产生的酶系对中药有生物转化作用[5]。本研究通过蛹虫草菌发酵以提高杜仲和杨树花中活性成分含量，再利用杜仲和杨树花中营养物质来促进虫草菌的生长，以提高抗菌抗病毒活性物质的产量。
1.1 试验材料
蛹虫草斜面ACCC50542(上海保藏生物技术中心)；
杨树花粉碎物、杜仲粉碎物(四川恒瑞通达生物技术有限公司)；
豆粕(济南绿之源生物科技有限公司)；
麸皮(新郑面粉厂)、土豆(新郑农贸市场)、蛋白胨、酵母粉(北京奥博星生物技术有限公司)；
葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钙(北京奥博星生物技术有限公司)。
1.2 试验仪器与设备
立式压力蒸汽灭菌锅(YXQ-LS-50G，上海博讯实业有限公司设备厂)；
恒温培养箱(GSP-9270MB，上海一恒仪器厂)；
恒温培养振荡箱(ZHWY-211B，上海双旭电子有限公司)；
紫外可见分光光度计(TU-1900，上海舜宇平科学仪器有限公司)；
单人净化工作台(SW-CJ-ID，上海古宁仪器有限公司)；
高效液相色谱仪(Waters e2695，美国沃特世公司)。
1.3 试验方法
1.3.1 蛹虫草菌种子液制备
1.3.1.1 种子液培养基制备
麦麸汁5%、土豆汁20%、葡萄糖2%，配制1500 mL培养基，分别制备一级种子培养液三瓶、二级种子培养液三瓶、三级种子培养液三瓶，121 ℃灭菌30 min，放凉备用。
1.3.1.2 种子液制备实验步骤
将蛹虫草菌种分别接种于三瓶100 mL培养液中，于26 ℃、180 r/min培养5 d，得到一级种子液。
将上述一级种子液以30%的接种量接种于100 mL培养液中，于26 ℃、180 r/min培养5 d，得到二级种子液。
将上述二级培养液以30%的接种量接种于200 mL培养液中，于26 ℃、180 r/min培养5 d，得到三级种子液。
1.3.2 蛹虫草发酵中药
1.3.2.1 发酵培养基制备
葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.1%、豆粕1%、麦麸20%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、碳酸钙0.1%、杜仲和杨树花粉碎混合物(4∶6)20%～40%，配制1000 mL培养基，121 ℃灭菌30 min，放凉备用。
1.3.2.2 发酵液制备
将三级种子液以40 %的接种量接种于上述发酵培养基中，总体积为200 mL，于26 ℃、180 r/min培养7 d，获得菌体发酵液。
1.3.3 单因素试验
1.3.3.1 最佳中药添加量
发酵培养基中分别添加20%、30%、40%杜仲和杨树花混合物(4∶6)，测定各项发酵产物的含量，筛选最佳的添加量。
1.3.3.2 最佳菌种接种量
在中药添加量一定的条件下，发酵培养基中分别添加30%、40%、50%的虫草菌种，测定各项发酵产物的含量，筛选最佳的菌种接种量。
1.3.3.3 最佳发酵温度
在中药添加量、菌种接种量一定的条件下，将培养温度分别设定为20 ℃、25 ℃、30 ℃，测定各项发酵产物的含量，筛选最佳的发酵温度。
1.3.3.4 最佳发酵时间
在中药添加量、菌种接种量、发酵温度一定的条件下，分别培养5 d、7 d、10 d后测定各项发酵产物的含量，筛选最佳的发酵时间。
1.3.4 多糖、多酚和甘露醇等指标的测定
1.3.4.1 多糖含量测定
精密称取在105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖100 mg，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5 mL该葡萄糖溶液置于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含葡萄糖50 μg的对照品溶液。
称取4.0 g样品于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，精密量取该溶液1 mL，置于500 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
精密量取对照品溶液和供试品溶液各2 mL，分别置于不同试管中，各加3%苯酚溶液2 mL，摇匀，迅速加入硫酸9 mL，摇匀，放置室温。利用紫外可见分光光度法，在490 nm波长处测定吸光度，计算即得出多糖含量。
1.3.4.2 多酚含量的测定
精密称取0.5 g样品至50 mL容量瓶中，加入适量60%乙醇溶液，超声30 min，放凉后定容至刻度，过滤，取上清液稀释10～20倍后备用。取1.0 mL上述样品于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL FC试剂和2 mL的15%碳酸钠溶液，用超纯水定容至刻度线，充分混匀后，40 ℃避光显色1 h，测定其多酚含量。以不加反应液的样品为空白样品，上机检测，得到样品的吸光度A，根据标准曲线计算检测样溶度C。
1.3.4.3 甘露醇含量的测定
精密称取0.2 g样品于250 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀备用。精密量取上述溶液10 mL于碘瓶中。精密加入高碘酸钠溶液50 mL，摇匀，水浴加热15 min，放冷后加入碘化钾溶液10 mL，摇匀放置5 min，用0.05 mol/L硫代硫酸钠滴定，至近终点时，加淀粉指示液1 mL，继续滴定至蓝色消失，用不加样品的溶液作为空白进行校正。
1.3.4.4 黄酮含量的测定
精密称取1 g样品置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇至总体积15 mL，依次加入硝酸铝溶液1 mL，醋酸钾溶液1 mL，摇匀，加水至刻度摇匀，静置1 h，利用紫外可见分光光度法，于420 nm处测定吸光度，以芦丁标准品按上述步骤制定标准曲线，计算得出黄酮含量。
2.1 不同中药添加量对发酵产物的影响
不同中药添加量对发酵产物影响如图1所示，当加入30%的中药混合物时，核心成分虫草多糖的含量最高，且多酚、甘露醇等活性物质含量较其它浓度条件下变化不明显。中药添加量达到40%时，发酵产物各项指标呈现下降的趋势。因此，选用30%的中药添加量为最佳。
2.2 不同接种量对发酵产物的影响
不同接种量对发酵产物的影响见图2，虫草多糖的含量与菌种含量呈正相关，而多酚、黄酮、甘露醇的含量随接种量的增加先升高后降低，原因可能是一定数量的发酵底物被利用消耗，使其发酵产物达到最大值后趋于平稳甚至降低。而虫草多糖源于菌种，菌种生长繁殖，其多糖含量也随之增加。因此，以40%的菌种接种量作为适宜的指标进行发酵。
图1 不同中药添加量对发酵产物的影响
图2 不同接种量对发酵产物的影响
2.3 不同温度对发酵产物的影响
温度是菌种生长繁殖的主要影响因素，适宜的温度能使发酵效果达到最大化。试验结果表明(图3)，发酵产物多糖、多酚、黄酮、甘露醇的含量均在25 ℃达到最大值，此温度也是虫草菌生长繁殖的适宜温度范围。
图3 不同温度对发酵产物的影响
2.4 不同时间对发酵产物的影响
由图4可知，发酵产物多糖、多酚、黄酮、甘露醇的含量在发酵7 d 时达到最大值。随着发酵时间再延长，菌种的营养逐渐消耗，活力也随之降低，故代谢产物也相应趋于平稳甚至减少。
图4 不同时间对发酵产物的影响
利用真菌发酵中药可显著提高其活性成分含量[6-8]。虫草真菌是一种药用真菌，其发酵中药可以实现一次发酵双向转化，同时获得两种药物的有效成分，起到协同增效的作用[9]。
不同的发酵条件与工艺均会影响菌种发酵产生的代谢产物[10]。本试验结果表明，随着中药添加量的提高到40%，虫草菌生长受到抑制，其代谢产生的主要成分多糖也因此减少，对杜仲和杨树花中药的生物转化作用也相对减弱，即多酚和甘露醇含量减少，这与徐丽丽[11]等的研究结果一致，说明中药可以为菌种发酵提供一定的营养物质如糖类、微量元素及氨基酸等，供其生长繁殖[12]。刘朋肖[13]等研究表明，菌种接种量对虫草菌的生长和胞外多糖的产生有影响，这与本研究结果相同。一定量的底物被菌种利用转化后，过多数量的菌种没有经济价值，合适的接种量即可使发酵达到最优化。不同的菌种其适宜的生长温度不同，虫草菌的适宜生长温度在25～30 ℃[14]，本试验结果显示，培养温度为25 ℃时，虫草菌发酵转化的能力最优，其繁殖能力最佳且代谢产生的酶活较高，可最大限度地转化杜仲和杨树花的药用成分。
本研究通过单因素试验对虫草菌液双向发酵杜仲和杨树花的工艺条件进行优化，为进一步研究中药的深层发酵奠定了基础。
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