田广磊,慈红波,侯梅华,宋巍,朱兵,陈雄,戈小虎*
静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism,VTE)包括肺栓塞及深静脉血栓形成,是一种以肺动脉及深静脉血管中异常血栓形成为特征的疾病[1]。其病情危重,若未得到及时、恰当的治疗,患者可有生命危险[2],且VTE的后遗症还会降低患者的生活质量[3]。孕妇及刚分娩的女性处于高凝状态,此时VTE的发生风险增加,是发达国家孕产妇死亡的主要原因之一[4]。目前VTE的确切病因仍不清楚,尽管相关研究显示创伤、骨折、妊娠及口服避孕药是VTE的潜在危险因素,但大多数合并上述风险因素的个体最终不会发展成VTE,这提示遗传易感性可能在其发生和发展中发挥重要作用[5-6]。为明确遗传易感性的作用,对孕产妇血栓相关基因多态性及其与VTE风险的相关性进行分析,现将研究结果报道如下。
1.1 一般资料
将2016年1月至2018年1月**维吾尔自治区人民医院收治的976例适龄孕产妇作为研究对象,根据研究对象是否确诊为遗传性易栓症或/和VTE将其分为病例组(330例)及对照组(646例)。诊断标准参照《易栓症诊断中国专家共识(2012年版)》[7]及《深静脉血栓形成的诊断和治疗指南》[8]制定。纳入标准:① 适龄孕产妇;② 年龄20～35岁;③ 单胎妊娠;④ 自然分娩孕妇。排除标准:① 年龄<20岁或>35岁;② 合并严重心、肺功能不全;③ 合并肝、肾功能不全者;④ 合并恶性肿瘤、自身免疫系统疾病患者;⑤ 合并静脉曲张、真性红细胞增多症等血液系统疾病;⑥ 原因不明的死胎史和/或复发性流产;⑦ 长期口服避孕药或激素替代治疗;⑧ 合并近期手术史者;⑨ 合并严重精神-神经系统疾病者。本研究经医院伦理委员会批准,所有研究对象均了解本研究内容,并签署知情同意书。两组年龄、孕周、孕产史等一般资料比较,病例组吸烟者比例高于对照组(均P<0.05),年龄、孕前BMI等其余情况比较差异无统计学意义(P>0.05),详见表1。
表1 匹配前两组一般资料比较[n(%)]
1.2 方法
1.2.1 倾向性评分匹配 根据未匹配前病例组和对照组的临床资料,使用R语言Matching软件包进行倾向性评分匹配。首先求得每个观测的各协变量的综合倾向性得分,按照倾向性得分是否接近进行1∶1匹配,以分组变量为因变量,其他影响结果的混杂因素为协变量构建Logistic回归模型,计算每个观测的VTE风险得分,根据拟合回归模型计算每个个体的倾向指数(范围0～1),反映个体被分到试验组的改良,设置卡钳值(最优卡钳值为0.02,0.03或倾向性评分值经Logistic转换后标准差的20%),按照得分大小进行匹配,之后对匹配后两组实验室等指标进行对比分析。
1.2.2 血栓相关基因多态性比较 经倾向性评分匹配后,比较两组人群凝血酶原基因rs3136447、rs5896位点及AnxA5基因rs1050606位点基因型及等位基因,并采用Logistic回归模型对不同基因型及等位基因与VTE的相关性进行分析,并比较不同基因型VTE患者相关指标的差异。
1.3 观察指标
所有患者均于纳入研究的次日抽取空腹静脉血,离心取上层血浆用于实验室相关指标检测,下层红细胞及白细胞置于-80℃环境保存,用于提取基因组DNA及后续研究,采用Sequenom Massarray检测技术进行基因分型。
抽取研究对象3 mL空腹静脉血,置于3.2%的柠檬酸钠抗凝管中,离心处理15 min(3 000 r/min),取上层血浆置于Eppendorf管中,置于-80℃环境中保存待检,检测前用37℃水浴解冻。采用发色底物法检测抗凝血酶Ⅲ(antithrombin,AT-Ⅲ)及蛋白C(protein C,PC)活性,采用凝固法检测蛋白S(protein S,PS)活性。活化蛋白C抵抗(activated protein C resistance,APC-R)用APCR敏感率量化,即APCR-SR=(APTT+APC)/(APTT-APC),采用全自动血凝仪(CA-7000型,日本Sysmex公司)测定常规活化部分凝血酶时间(APTT)即(APTT-APC),APTT+APC为添加活化蛋白C(APC)的APTT测定,其中APC浓度为3 mg/L。采用循环酶法检测同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平,仪器为全自动生化分析仪(AU5821型,美国贝克曼库尔特公司)。
1.4 统计学方法
2.1 病例匹配情况
采用最临近匹配法,匹配比例1∶1,卡钳值设为0.02,以病例组为基准组进行匹配,两组共162对匹配成功,在两组间的协变量经匹配后均达到平衡,经倾向性评分匹配后协变量的均衡性得到了明显提高(P>0.05)。详见表2。
表2 匹配后两组一般资料比较[n(%)]
2.2 两组实验室指标比较
病例组患者的AT-Ⅲ、PC、PS及APCR-SR活性低于对照组,Hcy水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),详见表3。
表3 两组实验室指标比较
2.3 两组血栓相关基因位点基因型及等位基因比较
两组人群rs3136447及rs5896位点基因型频率比较,差异无统计学意义(P>0.05),而两组患者rs3136447、rs5896等位基因频率及rs1050606位点基因型频率、等位基因频率比较,差异均有统计学意义(P<0.05),详见下页表4。
2.4 血栓相关基因多态性及等位基因与VTE的相关性分析
Logistic回归分析示FII基因rs3136447及rs5896位点基因型与VTE无明显相关性(均P>0.05),而rs3136447等位基因为T(OR=0.496,P=0.004)及rs5896等位基因为C(OR=0.314,P<0.001)则是VTE的独立保护因素;AnxA5基因rs1050606位点GG基因型(OR=2.803,P=0.024)及rs1050606位点G突变(OR=1.573,P=0.012)是VTE的独立危险因素,详见下页表5。
表5 血栓相关基因多态性及等位基因与VTE的相关性分析
VTE是因静脉血异常凝结,导致静脉回流障碍所引起的疾病,表现为患肢疼痛、肿胀及呼吸困难等,是产后严重并发症之一[9]。临床及遗传因素都有导致VTE的可能,大量研究表明,癌症、口服避孕药、高BMI等临床因素会显著增加VTE发生风险[10-11],但超过60%的VTE风险归咎于遗传因素[12]。
凝血酶原(因子II)是一种维生素K依赖性糖蛋白,由FII基因编码,激活后转化为凝血酶(因子IIa),参与凝血过程[13-14]。VTE是蛋白质分化或功能缺陷的结果,包括PC和PS,并已确定约8个人类基因的突变是致病原因[15],FII基因3′非翻译区的突变G20210A是公认的易栓症危险因素[16-17]。本研究结果显示,孕产妇VTE的发生可能与FII基因rs3136447、5896及AnxA5基因rs1050606位点基因多态性相关。
rs5896编码氨基酸位于凝血酶原K1区内,而K1区参与凝血酶(原)与其底物及辅因子间的相互作用,在机体凝血过程中扮演了重要角色[18]。既往研究证实,rs5896位点编码的165位氨基酸与其他维生素K依赖的凝血酶原相比较,具有高度保守性,据此推测165位的氨基酸残基与凝血酶原功能之间关系密切[19]。而rs5896位点上C>T的基因突变可使该位点的苏氨酸被甲硫氨酸取代,无法与180位的谷氨酸形成正常氢键,引起蛋白质空间结构及功能改变,从而导致蛋白编码异常,出现VTE[20]。rs3136447参与纤维蛋白凝血酶的合成过程,通过活化PC调节机体凝血过程,本研究结果显示rs3136447位点C>T的基因突变与VTE的发生密切相关,这可能与rs3136447位点基因多态性改变,导致凝血酶原活性及其下游因子凝血因子V的水平改变,从而出现PC拮抗,使凝血酶原复合物及凝血酶水平升高,最终导致机体处于高凝状态,从而发生血栓[21]。
血液凝固需凝血因子的配合,而凝血因子则需要磷脂辅助,方可形成相应的复合物,磷脂酰丝氨酸是至关重要的磷脂辅助因子,而AnxA5则是具有高度磷脂亲和力的蛋白,当组织受到创伤性损伤时大量释放,与磷脂形成二维的晶体结构,发挥抗凝血作用[13-14]。当ANXA5基因产生变化时,其结构功能变化,无法与活化的血小板膜表面的磷脂酰丝氨酸结合形成三聚体,导致二维晶体结构无法聚合,使其屏障层消失,无法将其他促凝因子隔开,使纤维蛋白原转化成纤维蛋白过程激活,从而出现血栓[15]。
本研究结果显示AnxA5基因rs1050606位点携带G基因是VTE的独立危险因素。启动子是调节AnxA5基因表达调控的关键环节,当rs1050606位点的胸腺嘧啶核苷酸(T)被鸟嘌呤核苷酸(G)所替代,可使ANXA5的转录活性降低,从而影响磷脂酰丝氨酸的表达,使其抗凝集屏蔽作用混乱,导致血栓形成,进而诱发VTE。而AnxA5基因rs1050606位点GG型基因则更易发生VTE。
综上,本研究结果显示孕产妇VTE的发生与孕妇体内血栓相关基因多态性相关,对于存在上述基因多态性的妊娠女性,应结合患者家族及个人史、既往临床前因、相关病理及对现有危险因素等进行综合评估,以分析此次妊娠期间出现血栓的风险,适度增加产检次数及必要的检查项目,尽早干预,逆转危险因素,降低血栓发生风险[15]。随着基因学研究的不断深入,可对影响血栓发生的基因作为靶点进行干预,为临床干预提供新的治疗思路。本研究并未对其基因突变的影响因素进行探究,故应行大样本、多中心的试验进一步探究地域、人群及饮食习惯等个体差异对基因多态性的影响,并对基因多态性的编码及其下游影响因子进行分析,以便为临床干预提供理论依据。
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