田蜜蜜, 穆秀杰, 张瑞含, 韩 毅
(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)
光合作用是绿色植物吸收光能将二氧化碳和水转化为有机物同时释放氧气的过程。光合作用为植物的生长发育提供物质和能量[1]。光呼吸作用伴随着光合作用同时进行,是绿色植物在光照条件下消耗氧气同时释放二氧化碳的过程[2]。研究表明,光呼吸和光合作用不仅在代谢途径上彼此相关,在代谢调节上也相互制约[3]。光呼吸作用始于核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco)所催化的反应[4]。在叶绿体内,Rubisco催化的加氧反应产生1分子的2-磷酸乙醇酸和3-磷酸甘油酸,2-磷酸乙醇酸在2-磷酸乙醇酸磷酸酶催化作用下,去磷酸化生成乙醇酸[5]。乙醇酸在乙醇酸甘油酸转运体和胆汁酸钠同向转运体的作用下运输到细胞质,然后通过未知的孔蛋白或通道进入过氧化物酶体[6]。在过氧化物酶体中,乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase,GOX)催化乙醇酸生成乙醛酸并产生过氧化氢[7]。GOX是植物光呼吸过程中的关键酶之一,不仅在光呼吸过程中发挥了重要的作用,还参与到植物的各种胁迫响应过程中,并且其活性也受到多种胁迫的诱导。例如豌豆在干旱胁迫条件下其GOX活性显著上调[8];病原菌入侵的条件下,大麦的GOX活性也大幅上升[9]。此外,GOX催化乙醇酸产生的过氧化氢参与到植物的胁迫响应过程中,从而激活一系列的下游防御反应[10]。
拟南芥GOX基因家族中有GOX1(At3g14420)、GOX2(At3g14415)、GOX3(At4g18360)、HAOX1(At3g14130)和HAOX2(At3g14150)5个成员[11]。相对于其他4个成员而言,缺乏GOX1的拟南芥体内表现出更高水平的乙醇酸的积累,表明GOX1是代谢乙醇酸并产生过氧化氢的主要异构体,并且在光呼吸进程中起主要的作用[12]。因此GOX1对于研究植物抵抗逆境胁迫机制有重要意义。本研究从野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia(Col-0)中克隆GOX1基因并对其进行生物信息学分析,为探索该基因的蛋白功能提供了理论依据,为进一步研究其抗逆机制奠定了基础。
1.1 材料
1.1.1 实验材料
野生型拟南芥、原核表达载体PET28a(+)、大肠杆菌DH5α克隆菌株、大肠杆菌BL21表达菌株均由本实验室保存。
1.1.2 实验试剂与仪器
反转录酶、dNTP聚合物、限制性内切酶(NheⅠ、HindⅢ)、Taq酶、T4DNA连接酶、咪唑(C3H4N2)、His标签镍柱、质粒提取试剂盒、切胶纯化试剂盒、琼脂粉、酵母提取物、胰蛋白胨、卡纳霉素(Kana,使用终质量浓度为50 μg/mL)。
主要仪器有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪、凝胶成像仪器分析系统、电泳仪、高温高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、真空泵等恒温培养震荡器、紫外分光光度计、冷柜等。
1.2 方法
1.2.1 生物信息学分析
用ExPASy-ProtParam 工具(https://web.expasy.org/protparam/)在线软件对GOX1基因编码的氨基酸进行基本理化性质的分析;采用ProtScale在线工具(https://web.expasy.org/protscale/)对 GOX1蛋白进行亲/疏水性分析;采用PSORT Prediction (http://psort1.hgc.jp/form.html)在线软件分析GOX1蛋白的亚细胞定位;采用 NetPhos3.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在线软件对GOX1蛋白进行磷酸化位点分析;利用NCBI数据库BLUST工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析GOX1蛋白的保守功能结构域;采用 NPS@: SOPMA secondary structure prediction 和SWISS-MODEL预测GOX1蛋白的二级结构和三级结构。
1.2.2 引物设计与合成
从tair网站搜索目的基因GOX1的CDS序列(GOX1的基因登录号为AT3G14420),再使用Primer5.0设计引物。上游引物GOX1-F:5’-CATGCTAGCATGGAGATCACTAACGTTAC CGA-3’(下划线部分为NheⅠ酶切位点);下游引物GOX1-R:5’-CCCAAGCTTCTATAACCTGG CTGAAGGACGT-3’(下划线部分为HindⅢ酶切位点)。
1.2.3 总RNA的提取和反转录cDNA
采用Trizol法对总RNA进行提取,利用反转录(reverse transcription,RT)得到cDNA,反应体系(10 μL)如下:2 μL 5×PrimeScript RT Mix;2 μg Total RNA;RNase Free ddH2O补齐至10 μL。反应条件为:25 ℃、10 min;42 ℃、30 min;85 ℃、5 min;4 ℃、3 min。
1.2.4GOX1基因的扩增和纯化
以拟南芥cDNA为模板,扩增GOX1基因的CDS序列。PCR(50 μL)反应体系如下:5.0 μL 10×buffer;4.0 μL dNTP;2.0 μL GOX1-F;2.0 μLGOX1-R;0.6 μLTaq酶;2.0 μLTemplate DNA;34.4 μL ddH2O。
PCR反应条件为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,30个循环;72 ℃延伸10 min。
使用普通DNA产物纯化试剂盒按步骤纯化目的基因扩增产物。
1.2.5 重组载体的构建和转化
利用NheⅠ、HindⅢ限制性内切酶双酶切载体质粒和目的基因扩增产物,胶回收酶切后的基因片段和载体片段,使用T4连接酶16 ℃中过夜连接。连接体系(10 μL)如下:2 μL 5×buffer;1 μL T4 DNA 连接酶;2 μL双酶切纯化GOX1基因片段;4 μL双酶切PET28a(+)载体片段;1 μL ddH2O。
将连接后的产物转化至大肠杆菌 DH5α感受态细胞,用卡纳霉素琼脂平板筛选阳性克隆,37 ℃过夜培养。挑选阳性克隆进行PCR和双酶切(NheⅠ/HindⅢ)鉴定,结果为阳性重组质粒,送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序正确后,将重组载体命名为PET28a(+)-GOX1。将重组载体PET28a(+)-GOX1转化至BL21感受态细胞,随机挑选单克隆进行 PCR鉴定,确认阳性菌落。
1.2.6 目的蛋白的诱导表达及纯化
将转化大肠杆菌 BL21的阳性单菌落接种在4只含有50 μg/mL Kana的400 mL液体培养基中,在200 r/min、37 ℃的条件下摇至菌的OD600为0.6～0.8即可,在每只锥形瓶中加入IPTG 120 μL(终浓度0.2 mmol/L),20 ℃的条件下表达16～24 h。
采用solution1(0.3 mol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl,pH值为7.6)重悬菌液沉淀,破细胞30 min,收集上清真空抽滤,用镍柱纯化诱导蛋白。分别用solution1、solution2(20 mmol/LTris-HCl,0.3 mol/L NaCl,50 mmol/L咪唑,pH 值为7.6)洗脱杂蛋白,然后用solution3(20 mmol/L Tris-HCl,0.3 mol/L NaCl,0.3 mol/L咪唑,pH值为7.6)洗脱目的蛋白。利用透析法除去咪唑,将GOX1蛋白保存在-80 ℃备用。
1.2.7 目的蛋白质量浓度和酶活的检测
以牛血清蛋白为标准蛋白制作标准曲线,将目的蛋白稀释合适的倍数后,使用紫外分光光度计在595 nm波长下测吸光度,再计算蛋白质量浓度。乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化成乙醛酸,生成的乙醛酸与苯肼反应生成苯腙。苯腙在324 nm处有强烈的吸收,使用紫外分光光度计测定样品在324 nm处吸光度的变化,测定时间[11]为5 min。
2.1 GOX1基因的基本理化性质分析
GOX1基因编码一条含367个氨基酸的肽链,分子式为C1 795H2 893N501O529S12,相对分子质量为40 341.48,理论等电点为9.16,脂溶性指数为94.14。该蛋白的不稳定参数为34.03,属于稳定性蛋白(小于40为稳定)。在氨基酸残基的组成上,丙氨酸(Ala)占比最高,达到11.2%。,使用NCBI Concserved Domain软件对GOX1蛋白进行保守结构域分析,结果如图1a所示。由图1a可知,该蛋白属于PLN02493超级家族。采用ExPASy-ProtScale对亲疏水性进行分析,结果如图1b所示,由图1b可知,GOX1蛋白为亲水性蛋白。对GOX1蛋白进行磷酸化位点预测分析,结果如图1c所示,由图1c可知,该蛋白含有31个磷酸化位点,分别为14个丝氨酸(Ser)、12个苏氨酸 (Thr)、5个酪氨酸(Tyr)。
图1 GOX1蛋白一级结构理化性质分析
2.2 二级结构和三级结构预测
GOX1蛋白的二级结构运用SOPMA在线软件进行分析,如图2a所示。由图2a可知,该蛋白的二级结构元件包括α-螺旋(41.14%)、无规则卷曲(37.06%)、伸展链(15.80%)和β-转角(5.99%),α-螺旋和无规则卷曲为该蛋白二级结构的主要元件。运用 SWISS-MODEL建模软件对GOX1蛋白三级结构进行预测分析,模型是以同源建模的方式模拟而出,是在二级结构基础上盘绕、折叠产生的特定空间结构,如图2b所示。
图2 GOX1蛋白二级、三级结构分析
2.3 GOX1的PCR扩增分析
以拟南芥野生型CDS为模板,以GOX1-F和GOX1-R为引物进行扩增,核酸琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示。
图3 PCR扩增GOX1基因片段核酸琼脂糖凝胶电泳图
从图3可以看出,扩增产物有一条特异性带,与拟南芥GOX1基因的大小相符(GOX1大小为1 104 bp)。
2.4 PET28a(+)-GOX1原核表达载体的鉴定
提取阳性菌落质粒进行测序,结果显示质粒中连接的目的基因与GOX1基因片段完全相符,未发生任何突变,将送去测序的菌落进行扩摇,提取质粒并转入表达菌株BL21,挑取单克隆进行菌落鉴定。利用Primer 5软件在PET28a(+)载体上设计引物PET28a(+)-F(TAGTTATTGCTCAGCGGTGG)和PET28a(+)-R(TCATGAGCGCTTGTTTCGGC),利用PCR扩增确认GOX1与载体是否成功连接,其电泳图如图4所示,从图4可以看出,条带在1 00～2 000 bp中间的位置,与实际大小1 500 bp相符,选取含目的基因的单克隆作为诱导菌种。
图4 菌落PET28a(+)-GOX1/BL21 PCR电泳图
2.5 GOX1蛋白的诱导及纯化
在22 ℃条件下,0.2 mmol/L IPTG诱导12～16 h,诱导后的蛋白SDS-PAGE电泳检测结果如图5所示。图5中:M代表Marker;泳道1代表PET28a(+)空载;泳道2代表PET28a(+)-GOX1诱导前蛋白表达情况;泳道3代表PET28a(+)-GOX1诱导后蛋白表达情况;泳道4代表PET28a(+)-GOX1诱导后经破细胞处理后的上清;泳道5代表PET28a(+)-GOX1诱导后经破细胞处理后的沉淀。
图5 GOX1蛋白诱导后的SDS-PAGE电泳图
此外,诱导的粗蛋白利用镍柱纯化,在蛋白上样后,带有His标签的融合蛋白特异性结合到柱子里,其他的杂蛋白随之流出。镍与咪唑发生竞争性结合,目的蛋白则被洗脱下来,即GOX1与杂蛋白成功分离,SDS-PAGE电泳检测不同时段的洗脱液,如图6所示。图6中:M代表Marker;泳道1～3代表杂蛋白的洗脱;泳道4～6代表目的蛋白洗脱的结果,泳道4的洗脱液含大量的目的蛋白,利用透析袋将该洗脱液的咪唑脱去后,将目的蛋白置于-80 ℃保存。
图6 GOX1蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图
2.6 GOX1蛋白的质量浓度及酶活检测分析
以牛血清蛋白为标准蛋白制作标准曲线,根据此标准曲线计算出表达的GOX1蛋白质量浓度为0.17 μg/μL。以乙醇酸为底物,测得酶活约为2.14 μmol/(mg·min)。
由于受到天气、区域环境和其他因素的影响,植物通常会在各种逆境胁迫下生长; 不断变化的环境通常给植物带来一定胁迫。例如干旱、低温、盐碱地以及二氧化碳浓度的增加等都会影响植物的生长发育,对农作物的产量和品质构成越来越严重的威胁。
在植物的细胞代谢过程中,有多种产生过氧化氢的方式,例如线粒体内的电子转移,叶绿体中发生的梅勒反应和过氧化物酶体中发生的光呼吸作用。而光呼吸途径产生的过氧化氢主要来源于GOX催化乙醇酸氧化的过程,因此人们认为GOX在植物抗逆防御反应过程中起着至关重要的作用,然而大多数情况下其响应胁迫的机制和信号途径还不清楚,有待进一步研究。
拟南芥因为其具有植株小、结实多、生命周期短;形态特征分明,突变表型易于观察;自交繁殖,易于保持遗传稳定性;基因组简单、遗传操作简便、适宜在实验室培养等优点,所以被认为是全球应用最广泛的模式生物。本研究通过 RT和PCR技术,从野生型拟南芥克隆了GOX1基因,并对其进行生物信息学分析。研究结果表明,该基因的CDS 序列为1 104 bp,编码一个由367个氨基酸组成的非分泌蛋白,主要由α-螺旋(41.14%)、无规则卷曲(37.06%)、少量的延伸链(15.80%)和β-转角(5.99%)构成。
在未来的工作中,将会进一步研究蛋白的体外功能以及通过转基因技术验证拟南芥GOX1基因调控生长发育的机理,更深层次地解释GOX1基因参与胁迫响应的分子机制。
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