王绿音，张慧，吕萍，李晶，梁成罡
中国食品药品检定研究院激素室 国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 102629
胰蛋白酶是一种能够特异性水解肽链中赖氨酸和精氨酸C-端肽键的丝氨酸蛋白酶［1］。作为生物制品生产中一种重要的生物源性材料，胰蛋白酶被广泛应用于病毒性疫苗、生物技术产品及其他医疗产品的生产制造［2-3］，如疫苗生产中动物细胞的传代培养、流感病毒疫苗中病毒颗粒的激活、胰岛素单链前体转化为双链胰岛素等［4-6］。目前国内的疫苗及胰岛素生产企业仍以动物源性胰蛋白酶（从猪或牛胰腺中分离纯化获得）为主，但存在生产工艺复杂、潜在人畜共患性病原污染的风险［7-8］。近年来，由于生产过程中使用动物源性胰蛋白酶导致生物制品被外源因子污染时有发生，引起人们对生物制品用胰蛋白酶安全性的广泛关注［9-10］。随着疫苗产业的发展，胰蛋白酶的市场需求量稳步上升。此外，生物制品生产所需原辅料的安全性越来越受到重视，无动物源性原辅料替代动物源性原辅料已成为必然趋势［11-12］。利用基因工程菌表达的重组胰蛋白酶因其纯度高，安全性好，理化性质稳定等优点受到越来越多的关注［13-14］。
重组胰蛋白酶系利用重组DNA技术在大肠埃希菌中表达的重组猪胰蛋白酶，其氨基酸序列与猪胰蛋白酶一致，由223个氨基酸构成，含6对二硫键。其含有两种胰蛋白酶活性形式：β-胰蛋白酶（相对分子质量23 463）和α-胰蛋白酶（相对分子质量23 481）［15］。具有活性的重组胰蛋白酶因其空间构象表面暴露有精氨酸和赖氨酸，易发生自水解，使得单链β-胰蛋白酶通过自水解形成双链α-胰蛋白酶，α-胰蛋白酶通过其内部二硫键维持结构，但其活性及稳定性均低于β-胰蛋白酶［16-17］。现行《欧洲药典》仅收载了动物组织提取的胰蛋白酶，《美国药典》自2015 年起将重组胰蛋白酶收入生物制药辅助用酶的标准中，《中国药典》自2020 年版起将重组胰蛋白酶收入三部通则，该标准包含纯度考察，需采用重组胰蛋白酶标准品对主峰进行定位，并计算α-胰蛋白酶峰与β-胰蛋白酶峰的分离度。本研究标化的标准物质系利用重组DNA 技术在大肠埃希菌中表达的重组猪胰蛋白酶，配以氯化钠及三羟甲基氨基甲烷-盐酸制成冻干品，其氨基酸序列与《美国药典》重组猪胰蛋白酶标准品一致。参考《中国药典》三部（2020版）通则3603、《美国药典》USP43-NF38＜89＞以及部分重组蛋白制品原料的关键控制项目，本研究制备了首批重组胰蛋白酶标准品，以规范并提高重组胰蛋白酶的质量。
1.1 胰蛋白酶 重组胰蛋白酶冻干品（批号：RPT-200701，含量：约14 mg／支）和重组猪胰蛋白酶标准品（USP Trypsin Recombinant Porcine RS，批号：1700013-F0M549，蛋白浓度：74 mg／mL，包装规格：2×1 mL）由上海雅心生物技术有限公司提供。
1.2 主要试剂及仪器 对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐、甲基红、亚甲蓝、三羟甲基氨基甲烷、N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzoyl-L-arginine ethyl ester，BAEE）盐酸盐、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钙、磷酸、盐酸和无水乙醇均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；
乙腈和甲酸为色谱纯，购自美国Fisher 公司；
Waters Xevo G2 XS-QTOF／UPLC飞行时间质谱仪和ACQUITY UPLC peptide BEH C4 色谱柱（50 mm ×2.1 mm，1.7 μm，300 Å）购自美国Waters公司；
LC-20AD高效液相色谱仪（LC-Solution工作站）、UV-2700紫外可见分光光度计和自动蛋白／多肽测序仪（PPSQ-33A）购自日本津岛公司；
HPLC色谱柱Sepax Bio C18（250 mm×4.6 mm，3 μm，200 Å）购自美国Sepax Technologies公司。
1.3 酶底物反应鉴别 按照《中国药典》三部（2020版）通则3603 重组胰蛋白酶鉴别方法操作。称取重组胰蛋白酶冻干品约2 mg，置白色点滴板上，加入对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐试液0.2 mL，搅匀，观察显色反应。
1.4 HPLC鉴别与纯度检测 采用HPLC法，在纯度项下记录的色谱图中，待标品β-胰蛋白酶主峰保留时间应与USP重组猪胰蛋白酶标准品的保留时间一致。
按照《美国药典》43 版及《中国药典》三部（2020版）通则3603 重组胰蛋白酶纯度测定方法操作，按峰面积归一化法计算待标品纯度。取重组胰蛋白酶冻干品1支，加入0.01 mol／L盐酸、0.02 mol／L氯化钙溶液［pH（2.0±0.2）］1 mL使其溶解，制成样品溶液，约1 mg／mL。取重组猪胰蛋白酶标准品140 μL，加入0.01 mol／L盐酸、0.02 mol／L氯化钙溶液［pH（2.0±0.2）］600 μL，制成标准品溶液，约1 mg／mL。HPLC 色谱柱为Sepax Bio C18（250 mm × 4.6 mm，3 μm，200 Å）；
流动相A 为0.1%磷酸溶液；
流动相B为0.1%磷酸-乙腈溶液；
流速为1.0 mL／min；
检测波长为280 nm；
柱温为40 ℃；
洗脱梯度为0 ～25 min：25% B→45% B，25 ～30 min：45% B→90% B，30 ～34 min：90%B，34 ～35 min：90%B→25%B）。取上述样品溶液和标准品溶液各5 μL 注入液相色谱仪，记录25 min内的色谱图。
1.5 质谱分子量测定 取重组胰蛋白酶冻干品1支，加纯化水溶解并稀释成质量浓度约为7 mg／mL 的样品溶液。采用ACQUITY UPLC peptide BEH C4色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，300 Å）；
流动相A 为0.1%甲酸溶液；
流动相B为0.1%甲酸-乙腈溶液；
流速为0.3 mL／min；
检测波长为280 nm；
柱温为60 ℃；
洗脱梯度为0 ～12 min：20%B→50%B，12 ～15 min：50%B→80%B，15～16min：80%B→20%B，16～25min：20%B；
进样量为5 μL；
采用ESI正离子模式；
扫描范围为m／z 500 ～4 000；
毛细管电压为3 kV；
脱溶剂气流为800 L／min；
脱溶剂气温度为350 ℃。
1.6 N-末端氨基酸序列测定 使用自动蛋白／多肽测序仪，采用Edman 降解法测定重组胰蛋白酶冻干品N-末端15个氨基酸序列。
1.7 活性分析
1.7.1 重组胰蛋白酶活性测定 按照《中国药典》二部（2020版）胰蛋白酶各论效价测定方法操作。取重组胰蛋白酶冻干品，按预估效价（5 000 U／支），用0.001 mol／L盐酸溶解并制成供试品溶液，约50 U／mL。取供试品溶液，加入底物溶液，立即计时，混匀，在（25.0±0.5）℃条件下保温，使用紫外-可见分光光度计，在253 nm 波长处，每30 s 读取吸光度，共5 min。以时间为横坐标，吸光度为纵坐标作图，取呈直线部分的吸光度，按下式计算每1 mg 供试品中含胰蛋白酶的量（P）。
P=（A1-A2）／0.003TW
式中A1为直线上终止的吸光度；
A2为直线上开始的吸光度；
T为A1至A2读数的时间（min）；
W 为测定液中含供试品的量（0.002 mg）；
0.003为在上述条件下，吸光度每分钟改变0.003，即相当于1 个胰蛋白酶单位。
1.7.2 蛋白质含量测定 按照《中国药典》三部（2020版）通则3603重组胰蛋白酶蛋白含量测定方法操作。取重组胰蛋白酶冻干品3 支，用0.01 mol／L 盐酸、0.02 mol／L氯化钙溶液［pH（2.0±0.2）］溶解并稀释，制成供试品溶液，约1 mg／mL。以0.01 mol／L盐酸、0.02 mol／L 氯化钙溶液［pH（2.0±0.2）］为空白溶液。使用紫外-可见分光光度计，在280 nm 波长处测定吸光度值，按下式计算供试品溶液的蛋白质浓度。
式中A280为供试品溶液在280 nm 波长下扣除空白对照后的吸光度值；
消光系数为1.36（1 mg／mL重组胰蛋白酶在该缓冲液中280 nm 波长下的吸光度值）。
1.7.3 比活性计算 按下式计算重组胰蛋白酶的比活性（每1 mg 质量的蛋白质中所含重组胰蛋白酶的活性）。
1.8 均一性分析 随机抽取重组胰蛋白酶冻干品12支，按照1.4项方法考察纯度，并计算RSD。
1.9 稳定性分析 取重组胰蛋白酶冻干品，于不同温度［25、40 ℃，相对湿度（relative humidity，RH）均为80%］及光照（4 000 lx）条件下放置不同时间（5、10 d），按照1.4项方法测定纯度，考察待标品的降解程度。
2.1 鉴别试验
2.1.1 酶底物反应鉴别 重组胰蛋白酶冻干品加入对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐试液后，即显紫色。
2.1.2 HPLC 法鉴别 在纯度项下记录的色谱图中，待标品β-胰蛋白酶主峰保留时间与USP重组猪胰蛋白酶标准品的保留时间一致，相对偏差＜2%，见图1。
图1 HPLC鉴别典型色谱图Fig.1 Typical chromatogram of HPLC identification
2.2 纯度 重组胰蛋白酶标准品主峰保留时间在12 ～17 min 内，α-胰蛋白酶与β-胰蛋白酶峰的分离度大于1。扣除空白对照，α-胰蛋白酶的前肩峰采用垂直积分，β-胰蛋白酶的拖尾峰采用切线积分，按峰面积归一化法计算待标品纯度，β-胰蛋白酶平均值为80.4%（n=12），修约为80%（应不低于70%）；
α-胰蛋白酶平均值为8.8%（n=12），修约为9%（应不高于20%）。见图2。
图2 纯度典型色谱图Fig.2 Typical chromatogram of purity
2.3 分子量 经测定，重组胰蛋白酶冻干品的α-胰蛋白酶平均分子量为23 481.138，β-胰蛋白酶平均分子量为23 462.754，均与理论值一致。见图3。
图3 重组胰蛋白酶待标品质谱图Fig.3 Mass spectrogram of candidate standards for recombinant trypsin
2.4 N-末端氨基酸序列 经测定，重组胰蛋白酶冻干品N-末端15 个氨基酸序列为IVGGYTCAANSIPYQ，与理论序列一致。
2.5 重组胰蛋白酶的活性
2.5.1 酶活性 采用BAEE 作为底物测定重组胰蛋白酶活性。在253 nm 波长处，BAEE 的紫外吸收值小于N-苯甲酰-L-精氨酸（N-benzoyl-L-arginine，BA）。在一定条件下，随着催化反应的进行，BAEE 逐渐减少，BA 逐渐增多，反应体系的紫外吸收值逐渐增加，以ΔA253计算胰蛋白酶的活性。3份供试品溶液的线性回归方程分别为Y=0.000 6X-0.043 6（R²=0.999 9）、Y=0.000 5X-0.031 5（R²=0.999 6）、Y=0.000 5X-0.001 4（R² = 0.999 8），平均重组胰蛋白酶活性为5 275 U／mL。
2.5.2 蛋白质含量 经测定，重组胰蛋白酶蛋白质含量平均为1.02 mg／mL。
2.5.3 比活性 重组胰蛋白酶的比活性为5 169 U／mg蛋白质（应不低于3 800 U／mg蛋白质）。
2.6 均一性 12支待标品的α、β-胰蛋白酶纯度和保留时间的RSD%均小于2.0%，表明待标品的均一性良好。见表1。
表1 均一性考察结果Tab.1 Uniformity of candidate standards
2.7 稳定性 重组胰蛋白酶在25 ℃，RH 80%条件下放置10 d，α、β-胰蛋白酶纯度均无明显下降；
在40 ℃，RH 80%条件下放置10 d，β-胰蛋白酶纯度略有下降，α-胰蛋白酶纯度略有升高。在不同温度条件下放置10 d，α、β-胰蛋白酶峰的保留时间均未发生显著变化。在4 000 lx 的光照强度下放置10 d，β-胰蛋白酶纯度由77.06%下降至75.62%，略有下降，α-胰蛋白酶未见显著变化，且α、β-胰蛋白酶峰的保留时间均未发生显著变化。见表2。
表2 稳定性考察纯度结果（%）Tab.2 Stability of candidate standards（%）
本研究制备的标准品作为首批重组胰蛋白酶国家标准品及纯度检查中定位的系统适用性标准品，首先应保证其结构的准确性。本研究对其结构进行了必要的研究，经酶底物反应鉴别、HPLC鉴别、N-末端氨基酸序列测定、质谱分子量测定，确认其结构与理论值一致。考察标准品纯度时，为提高方法的精密度及可操作性，将标准品配制为约14 mg／mL 的溶液，并将药典方法中的进样量由1 μL 调整至5 μL，测得主峰保留时间在12 ～17 min，β-胰蛋白酶纯度为80%、α-胰蛋白酶纯度为9%，二者的分离度大于1，符合药典标准要求。为明确适宜本标准品的运输条件，排除可能影响特性量值的因素，本研究进行了稳定性考察。将标准品于40 ℃，RH 80%条件下放置10 d，β-胰蛋白酶纯度由77.06%降至75.35%，α-胰蛋白酶纯度由9.71%增至10.68%；
而于25 ℃，RH 80%条件下放置10 d，α、β-胰蛋白酶纯度均未发生显著变化，表明温度升高可能促使β-胰蛋白酶水解产生α-胰蛋白酶。根据本标准品于40 ℃，RH 80%及4 000 lx光照条件下放置的纯度变化可知，本标准品应于2 ～8 ℃避光保存，并采用2 ～8 ℃避光条件运输。比活性是每mg 蛋白质的生物学活性单位，是重组酶的关键质量属性。本标准品按照《中国药典》三部（2020版）通则3603 进行研制，该通则中活性测定方法为《中国药典》二部（2020版）胰蛋白酶各论项下的方法，与《美国药典》43 版结晶胰蛋白酶各论项下的方法一致，均为活性单位定义法。该方法通过测定本标准品在（25±0.5）℃条件下，5 min内作用于特异性底物BAEE后的ΔA253计算其活性，其中呈线性关系的时间不得少于3 min。但该方法易受水解时温度变化、时间控制及实验人员操作等因素的影响。近年来，越来越多的酶类产品开始采用基于标准品的相对活性测定法，能适当减少上述因素的影响，提高检测结果的准确性及稳定性［18］。《欧洲药典》10.0胰蛋白酶各论中收载的活性测定方法亦为以BAEE 为底物的相对法。本研究研制的重组胰蛋白酶标准品目前可满足《中国药典》三部通则的用途，在此基础上，采用能够进一步涵盖国际药典协调需求的方法进行研究，有望将本标准品扩展为活性测定用标准品，具有更好的应用前景。
综上所述，本研究制备的重组胰蛋白酶国家标准品结构准确、纯度及比活性较高，可作为重组胰蛋白酶纯度系统适用性标准品，为重组胰蛋白酶效价测定用标准品的建立奠定了基础，有利于满足重组胰蛋白酶产品的生产放行及质量控制需求，对于加强疫苗、胰岛素及细胞治疗等生物制品工艺中使用的重组猪胰蛋白酶原辅料质量控制具有重要意义。
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