张 伟 洪 洋 陈晓菲 王晨晔 丁彩飞
复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）的发生率达1%～5%[1]，是生殖健康领域的常见疾病。连续发生自然流产2 次与3 次的病因构成相似，且发生2 次自然流产后再发风险升高[2]，因此将妊娠28 周之前，与同一配偶连续发生2 次及以上的自然流产定义为RSA，并推荐将反复生化妊娠纳入RSA 进行管理[3]。在妊娠过程中，T 细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（Tim-3）/半乳糖凝集素-9（Gal-9）信号通路调控母胎界面辅助性T 细胞1（Th1）/辅助性T 细胞2（Th2）及辅助性T 细胞17（Th17）/调节性T细胞（Treg）之间的平衡以维持母胎免疫耐受[4]，RSA的发生与母胎之间的免疫耐受异常密切相关[5]。本研究应用益肾安宫Ⅱ号对RSA 患者进行干预，检测外周血可溶性Tim-3（sTim-3）、Gal-9 的表达水平，探讨益肾安宫Ⅱ号治疗RSA 的作用机制，为临床应用益肾安宫Ⅱ号治疗RSA 提供实验依据，进一步丰富RSA 的治疗手段，报道如下。
1.1 一般资料 选择2020 年11 月至2022 年4 月就诊于浙江省中西医结合医院生殖医学科的RSA患者60 例，采用随机数字表法分为治疗组与对照组，每组30 例。选择同时期就诊的正常早孕期女性30 例为正常组。本研究经过医院伦理委员会审核通过，审批号：[2020]研审第（41）号。
1.2 诊断标准
1.2.1 西医诊断标准 参照《复发性流产诊治专家共识》[6]相关内容制定RSA 诊断标准：妊娠28 周前，自然流产连续发生2 次及以上。
1.2.2 中医辨证标准 参考《中医妇科学》[7]和《中药新药临床研究指导原则》[8]中滑胎的相关内容制定，符合脾肾两虚型：屡孕屡堕连续2 次及以上，神疲乏力，头晕耳鸣，腰膝酸软，精神萎靡，气短，纳差，大便溏，夜尿频数，面色萎黄或白，眼眶黯黑或有黯斑，肌肤不润，舌质淡嫩苔薄白，脉沉细滑，尺脉弱。
1.3 纳入标准
1.3.1 RSA 组纳入标准（1）符合西医诊断及中医辨证标准；
（2）自然流产2 次及2 次以上；
（3）孕周＜12 周；
（4）丈夫无精液异常；
（5）夫妻双方无染色体异常；
（6）无解剖结构异常；
（7）无自身免疫性疾病；
（8）无内分泌异常；
（9）无感染因素；
（10）无血凝分析异常。
1.3.2 正常组纳入标准（1）既往正常足月分娩至少1 次且无自然流产史；
（2）年龄与RSA 组相仿；
（3）B 超提示宫内早孕，可见心管搏动。
1.4 排除标准（1）生殖道畸形；
（2）急慢性感染期；
（3）男方精液异常；
（4）自身免疫性疾病；
（5）近期服用过免疫抑制剂；
（6）合并有糖尿病、高血压、心脏病、肝肾疾病及血液疾病；
（7）有吸烟及酗酒史；
（8）近3 个月内有疫苗接种史；
（9）未按规定服药无法判断疗效，或资料不全影响疗效判断者。
2.1 治疗方法 对照组口服地屈孕酮片（荷兰苏威制药，批号H20020632）10 mg，每天3 次黄体支持治疗，连续服用7 d 为1 个疗程，直至孕12 周停药。治疗组加用益肾安宫Ⅱ号[盐续断、桑寄生、杜仲、炒党参、熟地、炒白芍各15 g，菟丝子30 g，阿胶珠（烊兑）、茯苓、炒白术各12 g，甘草5 g]（杭州华东中药饮片有限公司），水煎服，每天1 剂，分早晚温服，连续服用7 d为1 个疗程，直至孕12 周停药。
2.2 检测指标及方法 治疗组及对照组分别于治疗前、孕12 周时采集静脉血3 mL，正常组于首次就诊时采集静脉血3 mL，在小试管中自然凝血后收集血清，-80 ℃保存待用。化学发光免疫法检测血清孕酮（P）、雌二醇（E2）、人绒毛膜促性腺激素（β-HCG）水平，酶联免疫吸附试验法检测血清sTim-3、Gal-9 水平。
2.3 疗效评定标准 参照《复发性流产诊治专家共识》[6]及《中药新药临床研究指导原则》[8]的相关内容修改制定：（1）治愈：妊娠超过28 周，孕28 周B 超示胎儿发育正常；
（2）好转：妊娠未超过28 周，但超过既往流产最大孕周，且既往流产孕周B 超示胚胎（胎儿）发育正常；
（3）未愈：妊娠未超过既往流产最大孕周即发生流产，B 超检查示胚胎发育不良或停止发育。总有效率=（治愈+好转）例数/总例数×100%。
2.4 统计学方法 应用SPSS 21.0 软件包进行统计分析。符合正态分布计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，治疗前后比较采用配对样本t 检验；
计数资料用率（%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05 认为差异有统计学意义。
3.1 三组研究对象一般资料比较 三组年龄、孕周比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。
表1 三组研究对象一般资料比较（）
表1 三组研究对象一般资料比较（）
注：治疗组予达芙通联合益肾安宫Ⅱ号口服；
对照组予达芙通口服；
正常组不予药物治疗
3.2 三组研究对象血清β-HCG、P、E2 水平比较治疗前三组β-HCG、P、E2 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗组与对照组β-HCG、E2 水平较治疗前显著上升（P＜0.05），且治疗组上升更明显（P＜0.05）。治疗组P 水平较治疗前上升（P＜0.05），对照组P 水平治疗前后无明显改变（P＞0.05）。治疗后，治疗组与对照组P 水平相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。
表2 三组研究对象血清β-HCG、P、E2 水平比较（）
表2 三组研究对象血清β-HCG、P、E2 水平比较（）
注：治疗组予达芙通联合益肾安宫Ⅱ号口服；
对照组予达芙通口服；
正常组不予药物治疗；
β-HCG 为β 人绒毛膜促性腺激素；
P 为孕酮；
E2 为雌二醇；
与同组治疗前比较，aP＜0.05；
与对照组治疗后比较，bP＜0.05
3.3 三组研究对象血清sTim-3、Gal-9 水平比较治疗前，治疗组与对照组sTim-3 水平无差异（P＞0.05），均明显高于正常组（P＜0.05）；
治疗组与对照组Gal-9 水平无差异（P＞0.05），均明显低于正常组（P＜0.05）。治疗后，治疗组与对照组sTim-3 水平均较治疗前明显下降（P＜0.05），且治疗组明显低于对照组（P＜0.05）；
治疗组与对照组Gal-9 水平均较治疗前明显上升（P＜0.05），且治疗组明显高于对照组（P＜0.05）。见表3。
表3 三组研究对象血清sTim-3、Gal-9 水平比较（pg/mL，）
表3 三组研究对象血清sTim-3、Gal-9 水平比较（pg/mL，）
注：治疗组予达芙通联合益肾安宫Ⅱ号口服；
对照组予达芙通口服；
正常组不予药物治疗；
sTim-3 为可溶性T 细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3；
Gal-9 为半乳糖凝集素-9；
与同组治疗前比较，aP＜0.05；
与对照组治疗后比较，bP＜0.05；
与正常组比较，cP＜0.05
3.4 两组RSA 患者临床疗效比较 治疗组总有效率93.33%，明显高于对照组73.33%（P＜0.05）。见表4。
表4 两组复发性流产患者临床疗效比较（例，%）
RSA 病因复杂，包括遗传、解剖、内分泌、感染、凝血及免疫因素，其中免疫因素是目前RSA 研究的热点问题[5]。妊娠过程类似半同种异体移植，母体免疫系统对胚胎携带的父方抗原产生免疫耐受是成功妊娠的关键，免疫耐受失衡会导致RSA[9]。研究发现，Th17/Treg 及Th1/Th2 比例失衡导致过度炎症反应，从而诱发母胎免疫耐受失衡[10]。
RSA 在中医学中归属于“滑胎”“数堕胎”“屡孕屡堕”范畴。主要病机为脾肾两虚、气血不足，治疗本病当以“补肾健脾、益气养血”为法。益肾安宫Ⅱ号由寿胎丸合四君子汤化裁而来，方中盐续断、桑寄生、杜仲、菟丝子补肾益精，炒白术、炒党参、茯苓益气健脾，炒白芍养血敛阴，阿胶珠、熟地养阴补血，甘草调和诸药。全方共奏健脾补肾、养血益气、固冲安胎之效。研究结果表明，益肾安宫Ⅱ号可提高RSA 患者保胎治疗效果，使RSA 患者外周血中Th17 细胞比例下降，Treg 细胞比例上升，Th17/Treg 失衡现象得以改善，有利于妊娠的维持[11]。本研究中，治疗组总体有效率高于对照组（P＜0.05），提示益肾安宫Ⅱ号联合地屈孕酮片治疗RSA 疗效明显优于单纯使用地屈孕酮片。
β-HCG 在妊娠早期能维持妊娠黄体持续增长，刺激黄体分泌孕酮，避免着床的胚胎受到排斥，维持妊娠[12]。孕期E2 主要由卵巢及胎盘产生，随着孕周呈递增趋势，其水平可作为早期胚胎发育标志[13]。本研究结果显示，治疗后，治疗组血清β-HCG 及E2 水平较治疗前显著上升（P＜0.05），且两者水平显著高于对照组（P＜0.05），提示益肾安宫Ⅱ号对RSA 患者血清β-HCG、E2 水平上升有促进作用，可改善子宫及胎盘的血液循环，为胚胎的顺利生长提供良好的内环境，使妊娠得以继续。
Tim-3 结合其配体Gal-9，产生抑制信号，诱导Th1 与Th17 细胞凋亡，负调节Th1 与Th17 细胞免疫应答[14]。外周血和母胎界面淋巴细胞中Tim-3 表达上调，可抑制免疫反应向Th1 偏移，维持体内Th1/Th2 平衡，有益于成功妊娠[15]。Tim-3 抑制Th17 细胞分化，促进Treg 细胞增殖[16]。上述研究提示，Tim-3-Gal-9 信号通路对维持T 细胞亚群的动态平衡起重要作用，有助于正常妊娠偏于Th2 与Treg 状态，维持母胎界面免疫耐受，确保成功妊娠。Tim-3 可通过金属蛋白酶从免疫细胞表面脱落，形成可sTim-3。相关研究表明，流产组外周血中sTim-3 的表达高于正常组[17-18]。推测其机制可能为Tim-3 在免疫细胞上的脱落，从而导致血清中sTim-3 的高表达。Lee 和Goverman[19]认为，sTim-3 与Tim-3 可竞争性结合其共同配体Gal-9，且sTim-3 的结合力和作用效果要优于Tim-3，可干扰Tim-3 与Gal-9 结合，削弱Tim-3-Gal-9 信号通路传递负性抑制信号，从而导致RSA的发生。
本研究结果显示，治疗前治疗组与对照组sTim-3 水平无差异（P＞0.05），均明显高于正常组（P＜0.05）；
治疗组与对照组Gal-9 水平无差异（P＞0.05），均明显低于正常组（P＜0.05）。提示RSA 患者血清sTim-3 水平明显高于正常妊娠者，而Gal-9 水平明显低于正常妊娠者。治疗后治疗组与对照组sTim-3水平均较治疗前明显下降（P＜0.05），且治疗组明显低于对照组（P＜0.05）；
治疗组与对照组Gal-9 水平均较治疗前明显上升（P＜0.05），且治疗组明显高于对照组（P＜0.05）。表明经益肾安宫Ⅱ号干预后，RSA 患者血清sTim-3 水平下降，Gal-9 水平上升，减少sTim-3 竞争性结合Gal-9，解除sTim-3 对Tim-3-Gal-9 信号通路的干扰，调节和恢复Tim-3-Gal-9 信号通路介导的母胎免疫平衡，降低流产风险，有益于妊娠结局，值得临床进一步推广应用。